Application of biotechnology in animal breeding

1. Application of biotechnology in animal breeding

2. The two key questions in animal breeding: • Where to go? • How to get there?

3. Where to go? Breeding objectives How to get there? • Estimation of breeding value • Phenotype • Pedigree • BLUP • Genetic marker • Traits measurements • Milk, growth, carcass, fertility • Males vs females • DNA technology • Reproductive technology Selection Mating

4. Biotechnology in Animal Breeding • DNA technology • Gene recombination • Genetic engineering • Genetic markers • Genetic maps • DNA fingerprint • Reproductive technology • MOET • IVM, IVF • Embryo sexing • Nuclear transplantation

5. DNA technology

6. Gene selecting • Isolation of DNA (gene selecting I) Objective - ค้นหายีนที่ควบคุมลักษณะจากดีเอ็นเอ หลักการ • DNA extraction จากเลือด หรือเนื้อเยื่อ • DNA library (จัดเก็บเป็นฐานข้อมูล) • DNA sequencing (หาลำดับเบส) • Gene synthesis หรือ gene cloning in vector • Gene purification (แยกยีนที่คัดเลือกได้)

7. DNA Transcription RNA Protein • Isolation of mRNA (gene selecting II) หลักการ • Synthesis complementary DNA (cDNA) from mRNA or protein • DNA cloning • Gene purification Reverse transcriptase Translation

8. DNA technology

9. Gene recombination • เป็นการรวมตัวกันของยีน • Genetic engineering   เลือกยีน ตัดชิ้นยีนที่ต้องการ ใส่ฝากในเซลล์สิ่งมีชีวิต เช่น แบคทีเรีย. เซลล์ไข่, และ sperm    

10. Researchers in the UK report that they have developed chickens that are genetically modified to prevent them spreading bird flu. (Credit: Image courtesy of University of Cambridge)

11. Gene Marker Association Candidate genes for growth and carcass GHSR = Ghrelin receptor IGF-I = Insulin like growth factor I cGH = chicken IGFBP2 = IGF binding protein II Significant effect of IGF1 for EBV were found Table: LSM for IGF1 genotype in CHEE  A C

12. Marker Assisted Selection in TIC Selection Index MAS Genotyping and Selection vIGF1 – allele A Selection HSP70 – C1C2 Avoiding HSP70 – M1M2

13. Porcine stress syndrome การตรวจสอบหา halothanegene ในสุกรโดยใช้ เทคนิค PCR M NN nnnnnnnnnnnnnnnnNnNN NnNnnnnnnn ภาพการตรวจสอบหา Halothane gene ในสุกรโดยที่ NN คือสุกรปกติ , Nnคือสุกรที่เป็นพาหะ nnคือสุกรที่มี Halothane

14. Double muscling in cattle due to mutations in the myostatin gene Mutations that reduce the production of functional myostatin lead to an overgrowth of muscle tissue Belgian Blue bull showing the double muscling phenotype

15. Impacts of the footrot gene-marker test on New Zealand sheep farming Footrot is a disease that costs New Zealand sheep farmers over $80 million a year to treat. Selective breeding using a Footrot Gene-Marker Test (FGMT) could significantly reduce the amount of footrot on farms. In 1997, Dr Jon Hickford and a team of researchers at Lincoln University isolated a gene that was linked to susceptibility or resistance to footrot. The scientists used their discovery to develop the Footrot Gene-Marker Test (FGMT) for use on farms.

16. The Laboratory is also well equipped to undertake commercial gene-marker testing. Currently six gene-markers are available commercially. Footrot gene-marker test Cold tolerance gene-marker test Scrapie genetics test Microphthalmia gene test T+muscling gene test Dermatosparaxis gene test

17. Genetic maps • A genetic map is a representation of the genes on a chromosome arrayed in linear order w ith distances between loci expressed as percent recombination (map units, centimorgans). Also called a linkage map.

18. A genome is first investigated • The map improves with the scientific progress and is perfect when the genomic DNA sequencing of the species has been completed. • During this process, the fragments are identified by small tags. These may be genetic markers (PCR products) or the unique sequence-dependent pattern of DNA-cutting enzymes. The ordering is derived from genetic observations (recombinant frequency) for these markers or in the second case from a computational integration of the fingerprinting data.

19. DNA fingerprint • เอกลักษณ์ทางพันธุกรรม • เป็นเทคโนโลยีที่นำมาศึกษาความสัมพันธ์ทางพันธุกรรม หรือตรวจสอบพันธุ์ประวัติ 1 2 3 4

22. Reproductive Technology • Artificial Insemination (A.I.) • Embryo Transfer and Related Technology • MOET • IVMandIVF • Cryopreservativeof embryo and oocyte • Sex Control • Embryo sexing • Sperm sexing • Cloning • Nuclear transplantation • Embryo splitting

23. Artificial Insemination (A.I) • ถ่ายทอดพันธุกรรมที่ดีของพ่อได้อย่างรวดเร็ว • Proven sire or Elite sire • ควบคุมโรคติดต่อทางการสืบพันธุ์ • Brucellosis • Foot and mouth disease • ลดต้นทุนการเลี้ยงพ่อพันธุ์ • เก็บน้ำเชื้อได้ปริมาณมากและเก็บได้นานหลายสิบปี

24. A.I. ข้อดีการผสมเทียม - ทำให้พันธุกรรมของพ่อที่ดี สามารถกระจายได้จำนวนมาก และกว้างขวาง - สะดวก รวดเร็วและลดต้นทุนการเลี้ยงพ่อพันธุ์ - การควบคุมโรค - เอื้อต่อการมีระบบการจัดเก็บข้อมูลที่ดี ทั้งนี้เนื่องจากมีข้อมูลทางสายเลือดชัดเจน

25. ... จำเป็นต้องมีบุคคลที่ได้รับการฝึกฝนเป็นอย่างดี 1.1 การรีดเก็บน้ำเชื้อ 1.2 การตรวจวิเคราะห์คุณภาพน้ำเชื้อ 1.3 การทำน้ำเชื้อแช่แข็ง 1.4การขนส่งน้ำเชื้อไปใช้ 1.5การเก็บรักษาน้ำเชื้อ (ทั้งชนิดเก็บได้นานและน้ำเชื้อสดซึ่งเก็บได้แค่ 2-3 วัน) 1.6การนำไปใช้ผสมเทียมและเทคนิคการผสมเทียม

26. 1. จับอุ้มพ่อพันธุ์เอาด้านหัวของไก่หันเข้าหาผู้อุ้ม 2. นวดกระตุ้นและรีดน้ำเชื้อ 3. จับแม่ไก่และปลิ้นทวาร จะเห็นรูเปิดของท่อนำไข่อยู่ทางด้านซ้ายของแม่ไก 4. ใช้กระบอกฉีดยาดูดน้ำเชื้อที่รีดจากพ่อพันธุ์ 5. ฉีดน้ำเชื้อจากพ่อพันธุ์เข้าสู่ท่อนำไข่แม่พันธุ์ 6. ฉีดน้ำเชื้อจนหมดจากนั้นค่อยๆ ดึงกระบอกฉีดยาออก ขั้นตอนนี้ทำด้วยความระมัดระวังเพราะน้ำเชื้อจะไหลย้อนออกมาทำให้ผสมไม่ติด การผสมเทียม (Artificial mating)

27. A.I Natural mating เทคนิค Multiple Ovulation and Embryo Transfer (MOET) (Donor) (Recipient) 1. Superovulation 2. Manipulation of estrous 3. A.I. 4. Embryo recoveryManipulation of estrous Embryo Transfer Pregnant ภาพที่ 1 ขั้นตอนการย้ายฝากตัวอ่อนในสัตว์

28. ข้อดี ของการย้ายฝากตัวอ่อน - ทำให้ได้ลูกจากแม่พันธุ์ชั้นเยี่ยมมากขึ้น - ช่วยเพิ่มความแม่นยำในการคัดเลือกแม่พันธุ์ - ไม่เสี่ยงต่อการนำโรคเข้าฟาร์ม - สามารถเก็บตัวอ่อนแช่แข็งไว้ใช้ในอนาคตได้ • จุดด้อย ของการย้ายฝากตัวอ่อน - ทำได้ยากกว่าและแพงกว่าการผสมเทียม - ตัวอ่อนได้รับผลจากแม่รับฝากที่แตกต่างกัน เนื่องจากสภาพแวดล้อมที่ต่างกัน

29. In vitro Maturation (IVM) andIn vitro Fertilization(IVF) acrosome Oocyte pick up Sperm 1stpolar body Swim up MatureCapacitation IVF Embryo ภาพที่ 2 ขั้นตอนการผลิตตัวอ่อนนอกร่างกายสัตว์ (ปฏิสนธิในหลอดแก้ว)

30. Steps in the IVF-ET Processes 2. normally fertilized eggs will have 2 nuclei in the center, one from the egg and one from the sperm. 3. the best quality embryos will have 8 cells. 1. the sperm are physically injected into egg 4. compacted embryos on day 3. 6. embryos that have continued development in culture and have developed to the blastocyst stage may be frozen. 5. development should be at the blastocyst stage ที่มา : www.stronghealth.com/.../ ivf/phototour.cfm

31. ข้อได้เปรียบของการปฏิสนธิในหลอดแก้ว กับการย้ายฝากตัวอ่อนธรรมดา • ได้ลูกมากกว่า เพราะเก็บไข่ได้บ่อยกว่า • สามารถเก็บไข่จากรังไข่ของตัวเมียที่เพิ่งตายมาใช้ได้ • สามารถลด generation interval ลงได้ โดยการเก็บไข่จากตัวเมียก่อนถึงวัยเจริญพันธุ์

32. Cryopreservative of embryo and oocyteการแช่แข็งตัวอ่อนและไข่ • เป็นวิธีการแช่แข็ง (freezing)ตัวอ่อนและไข่ที่อุณหภูมิต่ำ (-196 C) • เทคนิคนี้มีความสำคัญมากในการเก็บรักษาตัวอ่อน หรือเชื้อพันธุ์สัตว์ให้คงสภาพมีชีวิต จนกว่าจะถึงช่วงเวลาที่เหมาะสมจึงจะนำไปใช้ประโยชน์ต่อไป

33. Sex Control • Sexing sperm • Flow cytrometer • แยกโครโมโซม • X,Y ก่อนที่จะนำไปผสมกับไข่เพื่อให้ ได้ลูกที่มีเพศตามที่สนใจ

34. Sexing Embryo • ตัดแบ่งบางส่วนของ embryo มาตรวจเช็คเพศด้วยเครื่องมือ PCR

36. Gene Transfer • เป็นการย้ายยีนใดยีนหนึ่งจากบุคคลหนึ่งไปสู่บุคคลหนึ่งโดยใช้วิธีทางห้องปฏิบัติการ • ย้ายยีนจากสัตว์สู่แบคทีเรีย • ย้ายยีนจากสัตว์ตัวหนึ่งไปสู่สัตว์อีกตัวหนึ่งที่เป็นชนิดเดียวกันหรือต่างชนิดกัน Transgenic animal หมายถึงสัตว์ที่ได้รับยีนมาโดยการย้ายยีน

37. Transgenic animal + Novel gene Novel gene expression Able to Reproduce

38. Cloning Technology A time lines of cloning 1996 1997 1998 1999 2000 2001

39. 1. DNA cloning

40. 2. Embryo Splitting (Bisection)คือการตัดแยกคัพภะออกเป็น 2 ส่วนทำให้ได้ identical twin เป็นการเพิ่มประสิทธิภาพของ embryo transfer

41. Embryo splitting คือการตัดแยกคัพภะ (ก่อนระยะฝังตัว) ออกเป็น 2 ส่วนทำให้ได้ identical twin เป็นการเพิ่มประสิทธิภาพของ embryo transfer

42. Nuclear Transplantation - เอา nucleus ของไข่ออกนำ cell จาก embryo หรือเนื้อเยื่ออื่นมาใส่แทน- ทำให้ได้สัตว์ที่มีลักษณะปรากฏเหมือนกันเป็นจำนวนมาก - ทำให้ genetic variation ของประชากรลดลง

43. Nuclear transplantation การย้ายฝากนิวเคลียส แกะหน้าขาว ปี 2543.. ประเทศไทยได้ลูกโคแบงกัส จากการโคลนนิ่ง ตัวแรก ชื่อ “อิง”

44. ผลจากการใช้เทคโนโลยี ... ความผันแปรทางพันธุกรรมของสัตว์เลี้ยงจะลดน้อยลงเนื่องจาก - เน้นความสม่ำเสมอของสัตว์- ใช้พ่อพันธุ์น้อยตัว- สัตว์เลี้ยงมาจากบริษัทผู้ปรับปรุงไม่กี่ราย- จำนวนพันธุ์สัตว์ลดน้อยลง- มีแนวโน้มใช้การทำโคลนนิ่งมากขึ้น

45. แนวทางการรักษาความผันแปรทางพันธุกรรมไว้ใช้ในอนาคตแนวทางการรักษาความผันแปรทางพันธุกรรมไว้ใช้ในอนาคต -หาช่องทางการใช้ประโยชน์ใหม่ๆที่เหมาะสมเพื่อให้เกษตรกรยังคงเลี้ยงต่อไป- เลี้ยงไว้ในสถานีอนุรักษ์พันธุ์สัตว์- ผสมข้ามกับสัตว์ในพันธุ์ที่ยังนิยมเลี้ยงอยู่- เก็บรักษาอสุจิไข่คัพภะหรือเซลล์ไว้ในสภาพเยือกแข็ง

46. Ethical issues in animal biotechnology Animal rights - Recent action to allow animals to be patented reinforces the idea of animals as human property, rather than beings in their own right.

47. Animal welfare - Modern pigs have been bred to grow extra fast - some breeds now grow too fast for their hearts, causing discomfort when animals are too active - Broiler chickens are bred to grow fast - some now grow too fast for their legs Transgenic animals and religious food laws - Transgenic animals pose problems for religions that restrict the foods that their believers can eat, since they may produce animals that appear to be one species, but contain some elements of a forbidden species.

48. 200 l NaOH one punched of FTA card FTA card 30-40 minute  Eliminate NaOH Optimise PCR conditions Collect blood samples DNA extraction DNA extraction and PCR conditions 35 cycles

49. Cloning and Sequencing Allele ?5’ TTCGGGGCGCAA ACCTGGAA 3’ Allele ? 5’TTCGGGCCGCAA ACCTGGAA 3’ Allele ? 5’ TTCGGGGCGCAAACCTCGAA 3’ Allele ? 5’ TTCGGGCCGCAA ACCTCGAA 3’ Cloning and sequence analysis