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Elyara Helder Wendy. Abordagens. Diferenciação/Desenvolvimento de Th2. STAT3. STATs e Diferenciação. Diferenciação e epigenética. STATs X Células T CD4 +. Cytokine, 47: 149-156, 2009. JAK/STATs X Células T CD4 +.

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Presentation Transcript
slide1

Elyara

Helder

Wendy

slide2

Abordagens...

  • Diferenciação/Desenvolvimento de Th2
  • STAT3
  • STATs e Diferenciação
  • Diferenciação e epigenética
slide3

STATs X Células T CD4+

Cytokine, 47: 149-156, 2009.

slide4

JAK/STATs X Células T CD4+

Arch Immunol Ther Exp, 55: 231-245, 2007; Transplantation, 85: 1372-1377, 2008; Cytokine, 47: 149-156, 2009.

slide5

STATs X Células T CD4+

Curr Opin Immunol, 21(2): 161-166, 2009.

slide6

STAT3 - Estrutura

Apresenta 6 domínios conservados

Interação com DNA

Interação com PY

Interação proteína-proteína

Atividade transcricional

Arch Immunol Ther Exp, 55: 231-245, 2007; Transplantation, 85: 1372-1377, 2008; Cytokine, 47: 149-156, 2009.

slide7

STAT3 - Função

Importância de STAT3 → camundongos stat3-/- → morte durante o desenvolvimento embrionário

Proc Natl Acad Sci USA 94: 3801-3804, 1997.

slide8

STAT3 - Função

Ativado por diversas citocinas e fatores de crescimento

Clin Cancer Res, 13::5665-5669, 2007; Transplantation, 85: 1372-1377, 2008; Cytokine, 47: 149-156, 2009.

slide9

STAT3 - Função

↑ expressão de genes com funções inibitórias (IL-10, TGF-β);

↓ expressão de genes com funções pro-inflamatórias (IFNs, IL-12, TNF, MHCII, CD80/86)

Transplantation, 85: 1372-1377, 2008; Cytokine, 47: 149-156, 2009.

slide10

STAT3 - Tumor

Transplantation, 85: 1372-1377, 2008; Curr Opin Immunol, 20(2): 228-233, 2008.

slide11

STAT3 – Células T

STAT3 → papel crítico em vários tecidos

Células T CD4+ stat3-/-

Nenhum déficit evidente no desenvolvimento

Timo e compartimentos periféricos normais

Reduzida proliferação dependente de IL-6 e IL-2

Int Immunol, 10: 1747-1751, 1998; J Immunol, 161: 4652-4660, 1998.

.

slide12

STAT3 – Diferenciação de células Th17

Transplantation, 85: 1372-1377, 2008; Cytokine, 47: 149-156, 2009; Curr Opin Immunol, 21(2): 161-166, 2009.

.

slide13

STAT3 – Doenças inflamatórias crônicas

Uveite → grupo de doenças inflamatórias intraocular → envolvimento das células Th17

Modelo em camundongo:

Células T reativas – Th17

Doença inibida com anti-IL-17

CD4stat3-/- - resistentes a uveite

Nat Med, 13: 711-718, 2007

.

slide14

STAT3 – Doenças inflamatórias crônicas

Inflamação intestinal crônica → envolvimento das células Th17 e STAT3

slide16

Objetivo

Demonstrar função de STAT3 no padrão de resposta Th17 (modelo de colite)

e na expansão homeostática de TCD4+ naïve nos órgãos linfóides

slide17

Estabelecimento de modelo de colite, através da transferência de células TCD4+ naïve, para avaliar papel do STAT3

Controle: Stat3fl/fl

TCD4+

Baço e linfonodos

TCD4+ naïve

CD25-CD45RBhigh

iv

4.105

Rag2-/-

(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl

slide18

Estabelecimento de modelo de colite, através da transferência de células TCD4+ naïve, para avaliar papel do STAT3

9 weeks

STAT3 foi, portanto, crítico para o desenvolvimento de colite (órgão específico), bem como para respostas inflamatórias sistêmicas.

slide19

Papel de STAT3 no diferenciação deTh17: responsável pela produção de IL-17?

TCD4+ naïve

CD25-CD45RBhigh

Controle: Stat3fl/fl

Lâmina Própria

Linfonodos Mesentéricos

Baço

9 semanas

FACS TCD4+ IL17+

Rag2-/-

(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl

STAT3 é necessário para a produção de IL-17A, mas não para IFN-γ, em células TCD4+, utilizado modelo de colite.

slide20

Papel de STAT3 na conversão de células TCD4+ naïve para Treg em modelo de colite

Concentração homeostática de Treg nos doadores de TCD4+

Lâmina Própria

Linfonodos Mesentéricos

Baço

Controle: Stat3fl/fl

FACS TCD4+ Foxp3+

(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl

STAT3 tem pouco efeito sobre a expressão de Foxp3 em células TCD4+, na ausência de inflamação.

slide21

Papel de STAT3 na conversão de células TCD4+ naïve para Treg em modelo de colite

Concentração de Treg em ambiente inflamatório

TCD4+ naïve

CD25-CD45RBhigh

Controle: Stat3fl/fl

Lâmina Própria

Linfonodos Mesentéricos

Baço

9 semanas

FACS TCD4+ Foxp3+

Rag2-/-

(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl

STAT3 inibi a conversão de TCD4+ naïve para Treg Foxp3+, em ambiente inflamatório.

slide22

TCD4+ naïve

CD25-CD45RBhigh

IL-17A + Foxp3 +

Score Clínico

(Stat3-/-)

Cd4 Cre; Stat3fl/fl

Rag2-/-

slide23

STAT3 regula então quais genes envolvidos na diferenciação de padrão Th17?

Regulação gênica

Controle: Stat3fl/fl

ChIP-Seq

anti-pSTAT3

anti-H3K4Me

anti-CD3, anti-CD28

IL-6, TGF-β,

anti-IL-2, anti-IL-4 e anti-IFN-γ

IL-6

1h

TCD4+

Baço e linfonodos

TCD4+ naïve

CD4+CD44-CD62L+

(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl

72h

STAT3 liga-se a mais de 3000 genes

Liga-se a muitos genes associados a diferenciação de Th17

slide25

STAT3 regula então quais genes envolvidos na diferenciação de padrão Th17?

Expressão gênica

Controle: Stat3fl/fl

anti-CD3, anti-CD28

IL-6 e/ou TGF-β,

anti-IL-2, anti-IL-4 e anti-IFN-γ

IL-6

1h

Microarray

PCR em Tempo Real

TCD4+

Baço e linfonodos

TCD4+ naïve

CD4+CD44-CD62L+

(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl

72h

STAT3 regula positivamente modificações epigenéticas nos genes em que é alvo, aumentando sua expressão e, portanto contribui para estabilidade do padrão Th17.

slide26

Ainda no modelo de inflamação sistêmica através de colite ...

TCD4+ naïve

CD25-CD45RBhigh

  • Lâmina Própria
  • Linfonodos Mesentéricos
  • Baço

Controle: Stat3fl/fl

9 semanas

FACS TCD4+

Rag2-/-

(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl

Apesar da ausência de inflamação corroborar com pequeno infiltrado de células no recipiente Rag2-/-, porque as células TCD4+ Stat3-/- não se acumulam num recipiente linfopênico?

slide27

Criando-se um ambiente inflamatório junto com a transferência de células TCD4+ Stat3-/-, estas acumular-se-iam nos órgãos linfóides?

  • Lâmina Própria
  • Linfonodos Mesentéricos
  • Baço

9 semanas

FACS

TCD4+ CD45.1

TCD4+ Cd4 Cre; Stat3 fl/fl

Portanto, STAT3 tem papel importante na expansão de células T, num ambiente inflamatório.

slide28

E como seria a expansão das células TCD4+ na ausência de inflamação?

TCD4+ naïve

CD25-CD45RBhigh

Controle: CD45.1

2 semanas

  • Linfonodos Mesentéricos
  • Baço

FACS TCD4+

Rag2-/-

(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl

A inabilidade de células TCD4+ Stat3-/- em acumular-se indica que STAT3 tenha papel na expansão de células T, anterior ao estabelecimento da inflamação.

slide29

Qual seria a importância de STAT3 na expansão homeostática de células T?

  • Timo
  • Linfonodos Mesentéricos
  • Baço

Controle: CD45.1

8 semanas

Medula óssea

FACS células T

Rag2-/-

(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl

slide30

Qual seria a importância de STAT3 na expansão homeostática de células T?

  • Timo
  • Linfonodos
  • Baço

Controle: CD45.1

MO

1:1

8 sem

FACS

TCD4+ CD45.1

TCD4+ Cd4 Cre; Stat3 fl/fl

Rag2-/-

(Stat3-/-): Cd4 Cre; Stat3fl/fl

Modelo reconstituição competitiva

Portanto, STAT3 tem papel essencial na proliferação celular de TCD4+ não somente em ambientes patológicos, mas também a partir de células tronco.