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实验五 1. 酶联免疫吸附试验（ ELISA) 2. 补体结合反应

实验五 1. 酶联免疫吸附试验（ ELISA) 2. 补体结合反应. 1. 酶联免疫吸附试验（ ELISA). 免疫标记技术. 定义： 将抗原 - 抗体反应与标记技术相结合，用 放射性同位素、酶或荧光素 标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。 分类： 放射免疫测定法： 131 I ， 32 P 免疫荧光技术： FITC ， PE 免疫酶测定法： HRP ， AP. 免疫酶测定法 ( E nzyme I mmuno A ssay,EIA). 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。 辣根过氧化物酶 (HRP) ，碱性磷酸酶 (AP)

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实验五 1. 酶联免疫吸附试验（ ELISA) 2. 补体结合反应

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  1. 实验五 1.酶联免疫吸附试验（ELISA)2.补体结合反应

  2. 1.酶联免疫吸附试验（ELISA)

  3. 免疫标记技术 • 定义： 将抗原-抗体反应与标记技术相结合，用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。 • 分类： • 放射免疫测定法：131I，32P • 免疫荧光技术：FITC，PE • 免疫酶测定法：HRP，AP

  4. 免疫酶测定法(Enzyme ImmunoAssay,EIA) • 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。 • 辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP) • 特点： • 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 • 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测 • 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值 • 分类： • 酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 • 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。

  5. 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA) 1.定义 用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。 • 间接法（Indirect ELISA）： • 将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗 • 检测液相中未知抗体 • 双抗体夹心法（Sandwich ELISA)： • 将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗 • 检测液相中的可溶性抗原 • 竞争法（Competitive ELISA) ： • 将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体 • 检测液相中的可溶性抗原或抗体 2.分类

  6. 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA) 3. 原理（以间接性ELISA为例）： 显色

  7. 实验内容：间接法测定溶血素 ——定性检测

  8. 实验材料 • 脱纤维绵羊红细胞——抗原 • 兔抗绵羊红细胞抗体（溶血素）——待测兔血清 • HRP标记羊抗兔IgG ——二抗 • 包被缓冲液：0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液 • 洗涤液：含0.05% Tween 20的0.01M pH7.4 PBS • 底物缓冲液： pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液 • 底物溶液：OPD 10mg，底物缓冲液25ml，30% H2O2 40μL • 酶标板，酶标仪

  9. 实验方法 脱纤维绵羊血 加3mL N.S，混匀 2000rpm，5min 1.抗原的处理： 加3mL N.S，混匀 2000rpm，5min 取2mL压积红细胞 加入2mL蒸馏水，震荡破碎红细胞 用包被缓冲液稀释成1：400备用 取酶标板，加入100μL/孔的抗原稀释液 2.包被抗原： 4℃，湿盒内，18h

  10. 取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体 实验方法 以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次 1 2 3 4 3.加待测血清 标记各孔，加入相应液体100μL/孔 空白 阴性 阳性 待测 37℃，湿盒内，30min 甩干孔内液体 4.加二抗： 以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次 各孔加入酶标二抗100μL/孔 37℃，湿盒内，30min 甩干孔内液体 5.显色： 以洗涤液（200μL/孔）洗涤3次，3min/次 加入底物溶液100μL/孔 6.观察结果 避光显色，10min

  11. 预期结果 • 阳性：显色为黄色 • 阴性：无色 1 2 3 4 阴性 阴性 阳性 阳性

  12. 注意事项 • 洗涤彻底，避免交叉污染。 • 按顺序加样，孔底无气泡。 • 包被和温育在湿盒内进行。

  13. 2.补体结合反应（Complement fixation Test, CFT）

  14. 补体结合反应： 是指在补体的参与下，以绵羊红细胞（SRBC）和溶血素（抗SRBC的抗体）作为指示系统的抗原抗体反应。 概念：

  15. 原理： 补反中包括两个系统五种成分： • 待检系统：已知Ag或Ab、待检Ab或Ag及仅供一组Ag-Ab系统反应的定量补体。 • 指示系统：绵羊红细胞和溶血素。

  16. 1 2 1：No Ab；2：Ab 待测系统 抗原+未知血清 指示系统 SRBC+抗SRBC抗体 补体 1 2 1 2 Step 1 抗原抗体复合物的形成 Step 2 补体的结合和耗竭 Step 3 SRBC的裂解

  17. 待测血清 Y Y Y Y Y Y Y Y Ab 阳性 No Ab 阴性 Ag Ag Ag Ag Y

  18. 材料： • 抗原：伤寒菌裂解产物 • 待测血清：56℃，30min • 补体：豚鼠血清 • 2%绵羊红细胞 • 溶血素

  19. 血清 对照管 抗原 对照管 补体 对照管 SRBC 对照管 试验管 方法： 1 2 3 4 5 （1份/2人） … … … … … … 0.2mL 0.2mL 待测血清 抗原 … … … … … … 0.2mL 0.2mL 补体 … … 0.2mL 0.2mL 0.2mL 0.2mL N.S … … 0.2mL 0.4mL 0.8mL 0.2mL 摇匀，37℃，水浴15min … … 溶血素 0.2mL 0.2mL 0.2mL 0.2mL 0.2mL 0.2mL SRBC 0.2mL 0.2mL 0.2mL 摇匀，37℃，水浴15min

  20. 预期结果： 1．管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透明呈红色为溶血。 溶血 不溶血 2.

  21. 注意事项： • 绵羊红细胞用前应轻晃混匀，不可剧烈震荡。 • 各种试剂的吸管不可混用。

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