1 / 8

实验十一、琼脂糖凝胶 RNA 电泳

实验十一、琼脂糖凝胶 RNA 电泳. 一、概述. RNA 分子有很多二级结构，需经变性剂处理，可以破坏 RNA 中的二级结构。然后，用琼脂糖凝胶电泳可分级分离不同大小的 mRNA 分子。常用的 RNA 琼脂糖凝胶电泳方法有三种 : 乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞琼变性电泳。. 二、 RNA 甲醛变性电泳. 1 、材料 :

stuart-maldonado
Download Presentation

实验十一、琼脂糖凝胶 RNA 电泳

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. 实验十一、琼脂糖凝胶RNA电泳

  2. 一、概述 RNA分子有很多二级结构，需经变性剂处理，可以破坏RNA中的二级结构。然后，用琼脂糖凝胶电泳可分级分离不同大小的mRNA分子。常用的RNA琼脂糖凝胶电泳方法有三种: 乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞琼变性电泳。

  3. 二、RNA甲醛变性电泳 1、材料: • 5 X MOPS电泳缓冲液：20.9g MOPS (0.1mol/L), pH7.0; 8.3ml 3mol/L NaAC(40mmol/L); 10.0ml 0.5mol/L EDTA (5mmol/L) pH8.0, 用水定容至1L. 以上药品和水均需用DEPC处理。 • 10 x甲醛上样缓冲液：1mmol/L EDTA, pH8.0; 0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯蓝，50%甘油). • 37% 甲醛（pH 大于4.0，12.3mol/L）; • 甲酰胺; • 10mg/ml溴化乙锭. • 以上药品和水均需用DEPC处理。

  4. 2、实验步骤 • 胶的制备：1.5g琼脂糖加115ml水，加热融化。冷却至60℃时加30ml的5 X MOPS电泳缓冲液 (终浓度为1X); 加5ml甲醛（琼脂糖终浓度为1%）。制胶。 • 样品制备： RNA (最多30ug) 5.5ul 5 X MOPS电泳缓冲液 2.0ul 甲醛 3.5ul 甲酰胺 10ul 在65℃下处理15min, 然后置冰上。 • 加样品前，先用5v/cm电压电泳5分钟。 • 制备好的样品短暂离心后加10X上样缓冲液2ul，混匀。 • 上样。

  5. 2、实验步骤（续） • 在1 X MOPS电泳缓冲液中电泳2-3小时。在电泳1-2小时后，可混合正负极缓冲液，再继续电泳。 • 染色：将电泳好的胶板转移至含0.5ug/L溴化乙锭的0.1mmol/L NH4AC溶液中染色30-40min. （溴化乙锭也可以在电泳前加于样品中） 注意： • RNA大于1kb, 用1%琼脂糖；RNA小于1kb, 用1.4%琼脂糖。 • 28SRNA 分子量为6333；18SRNA 分子量为2366.

  6. 三、 RNA羟甲基汞变性电泳 1、试剂： • 琼脂糖 • 羟基甲汞 • 1ｘ羟甲基汞琼脂糖凝胶电泳缓冲液（50mmol/L 硼酸，5mmol/LNa2B4O7·H2O，10mmol/L NaSO4，Ph8.1） • 2ｘ羟甲基汞凝胶上样缓冲液（1mol/L 羟甲基汞25ul，4ｘ羟甲基汞凝胶电泳缓冲液500ul，甘油200ul，溴酚蓝2ug，H2O275ul） • 10mg/ml溴化乙锭 • 10mol/L乙酸铵

  7. ２、实验步骤 • 将1%（RNA>1kb）或1.4%(RNA<1kb)的琼脂糖溶于1x羟甲基汞琼脂糖凝胶电泳缓冲液中，待溶液冷却至55℃时加入羟甲基汞至终浓度为5mmol/L. • 将RNA溶液与2×凝胶上样缓冲液等体积混合(每个0.6cm标准样品槽可加10ugRNA),　上样． • 在5~6V/cm下电泳12~16小时. • 电泳结束后,RNA可在含0.5ug/ml溴化乙锭的0.1mol/L乙酸铵溶液中染色30~45分钟，然后在紫外灯下检查.

  8. 3.　注意事项 • 羟甲基汞应加在凝胶中, 羟甲基汞不带电荷,在电泳过程中不会迁移,但当凝胶被缓冲液浸没时,它会扩散出来，因此电泳前需调节缓冲液面高度,使凝胶底部与液面接触。上完样,待样品电泳进入凝胶后,用保鲜膜盖住凝胶,防止挥发。 • pH<7.0时, 羟甲基汞与RNA解离从而起不到作用，所以电泳缓冲液需调pH至8.1。 • 羟甲基汞能与丙烯酰胺游离基团反应, 故不能用聚丙烯酰胺凝胶电泳。 • 不能用含氮碱、EDTA或Cl－的缓冲液，因为它们能与羟甲基汞形成络合物。 • 羟甲基汞剧毒，应小心操作。

More Related