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许冰莹, Tel:0871-65922837； 13769175605 Email:bingying_xu@126.com. 昆明医科大学法医学院. 第十一章 酶型. 昆明医科大学法医学院法医物证学教研室 许冰莹. 教学内容和目的要求：. ＊ 1. 熟悉红细胞酶型的概念。 ＊ 2. 熟悉 EAP 的表型与基因型关系，以及各自遗传规律。 3. 了解 EAP 的等位基因结构与命名。 学时安排： 课堂讲授 1 学时。. 第十一章 酶型. 第一节 概 述 第四节 红细胞酸性磷酸酶（ EAP ）. 第一节 概 述.

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Presentation Transcript

  1. 许冰莹, Tel:0871-65922837；13769175605Email:bingying_xu@126.com 昆明医科大学法医学院

  2. 第十一章 酶型 昆明医科大学法医学院法医物证学教研室 许冰莹

  3. 教学内容和目的要求： ＊1.熟悉红细胞酶型的概念。 ＊2.熟悉EAP的表型与基因型关系，以及各自遗传规律。 3.了解EAP的等位基因结构与命名。 • 学时安排：课堂讲授1学时。

  4. 第十一章 酶型 第一节 概 述 第四节 红细胞酸性磷酸酶（EAP）

  5. 第一节 概 述 ＊一.酶、同工酶和酶型的概念 二.同工酶的分类及命名 ＊三.同工酶的分型的原理和方法

  6. ＊一.酶、同工酶和酶型的概念(concept of enzyme 、Isozymes and enzyme type ) 1.酶(enzyme) 具有催化活性的蛋白质。 人类几乎所有的生命活动，都是通过一系列复杂的生 物化学反应来完成—酶的催化作用。 酶—生物催化剂

  7. ＊2.同工酶(isoenzymes) 指能催化相同的生物化学反应， 但蛋白质 分子结构不同的一类酶。 同工酶：活性中心: 结构相同 非催化部位: 结构差异

  8. ＊3.多态性同工酶 (polymorphic enzyme) 指在同工酶中由遗传基因决定，在不同个体之 间表现出酶蛋白分子一级结构差异， 并据此 可将人群分为若干类型的同工酶。 酶型就是一类多态性同工酶。 已经发现人类红细胞中有20余种多态性同工酶。

  9. 二. 同工酶的分类（The classification of isozyme） §根据同工酶编码基因的特点：三类 1. 复基因座位同工酶（multiple gene loci） 2. 复等位基因同工酶（multiple allele） 3. 遗传变异体同工酶（genetic variants）

  10. 1.复基因座位同工酶（multiple gene loci） 又称遗传独立同工酶，由几个不同基因座位的基因 编码，然后编码产物经过组装成为完整的酶蛋白分 子。这类同工酶各亚基的一级结构差异很大。 乳酸脱氢酶(LDH)：H4、H3M1、H2M2、H1M3和M4 磷酸葡糖变位酶(PGM)：PGM1，PGM2，PGM3

  11. ＊2. 复等位基因同工酶（multiple allele） 由同一基因座位上的多个等位基因编码，这些基因一般都表现为显性 基因， 各等位基因编码的蛋白质一级结构不同，具有个体差异，成为个 人识别的基础。法医学应用的多态性同工酶都是复等位基因同工酶。 PGM1:PGM1﹡1 +, PGM1﹡1 – , PGM1﹡2 + ，PGM1﹡2 –。 4个等位基因，决定10种表型。

  12. 3. 遗传变异体同工酶（genetic variants） 由单基因座的基因突变产生的同工酶。这类同工 酶的发生是由亲代某一基因发生突变，由突变等位基 因编码的一条特异的多肽链。 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)： 140 多种变异体。

  13. 三. 同工酶的分型原理和方法（Isozyme typeing principle and method） 原理：利用不同酶分子的电泳特性差异进行检测。 (Using different enzyme electrophoretic characteristics differences were detected) 方法：采用凝胶电泳的方法进行分型和酶谱显示。 (Using gel electrophoresis method for typing、Enzyme spectrum display)

  14. 三. 同工酶的分型原理和方法（Isozyme typeing principle and method） 1. 电泳分离（区带电泳或等电聚焦电泳） （1）区带电泳(Zone electrophoresis)： 利用不同酶蛋白分子的大小和所携带电荷数量的 差异，在电泳介质中迁移率不同，而形成清晰的区带。 并利用酶的催化活性，作用于底物，使之显带，根据 电泳谱型进行判型。

  15. 三. 同工酶的分型原理和方法（Isozyme typeing principle and method） 1. 电泳分离（区带电泳或等电聚焦电泳） （1）区带电泳： 电泳过程中，待分离的各组分在支持介 质中被分离成许多条明显的区带—区带电泳。 Why？

  16. 三. 同工酶的分型原理和方法（Isozyme typeing principle and method） （2）等电聚焦电泳(Isoelectric focusing electrophoresis)： 根据不同酶蛋白分子的等电点（ PI ）不 同，在pH梯度介质中，酶蛋白分子聚焦在相应 的等电点pH位置上，形成狭窄而清晰的区带,使 不同PI的酶蛋白分子得以分离。

  17. 三. 同工酶的分型原理和方法 （Isozyme typeing principle and method） 2. 酶谱显示(Enzyme spectrum display) 酶蛋白分子经电泳分离后，利用酶特异性的催 化活性，在凝胶上原位操作，使之显色，表现出 特征性谱带，称为酶谱，据此作出同工酶型的判 断。

  18. 三. 同工酶的分型原理和方法 2. 酶谱显示(Enzyme spectrum display) (1)直接底物显色法(Direct chromogenic substrate method)： 在酶的作用下，无色的底物被酶的催化反应转变成有 色产物，从而显现酶的谱带。常用于测定水解酶。 例如： 酚酞磷酸盐 磷酸 ＋ 酚酞 （无色底物） （有色产物） 红细胞酸性磷酸酶

  19. 三. 同工酶的分型原理和方法 2. 酶谱显示(Enzyme spectrum display) (2)荧光染色法(Fluorescent staining method)： 在酶的催化下，非荧光底物生成高度荧光的产物或荧 光底物转化成非荧光产物， 前者称为正荧光染色， 后者称为负荧光染色。 例如： 4－甲基伞形酮醋酸盐羧酸阴离子＋甲基伞形酮 （非荧光物质）（发荧光） 酯酶D

  20. 三. 同工酶的分型原理和方法 3.电子转移染料染色法(Electron transfer dye staining method)： 在酶的催化下，反应底物转化成新的产物同时，使氧化型辅 酶NAD + 或NADP + 还原成NADH或NADPH，同时提供电子。 NADPH 在催化剂吩嗪甲酯硫酸盐（PMS）存在下，使染料噻吩 兰（MTT）还原为暗蓝紫色不溶性的甲月替而显示酶谱带。 例如： PGM1 同工酶的酶谱显色就采用此法。

  21. 第二节 红细胞酸性磷酸酶（EAP）（erythrocytic acid phosphatase） 一.生化性质与生物学功能 (Biochemical properties and biological functions of EAP) 二.等位基因结构与命名 (The allelic structure and naming) 三.群体遗传学调查 (Population genetics investigation) 四.分型方法(typing method )

  22. 一.EAP的生化性质与生物学功能(Biochemical properties and biological functions of EAP)

  23. 一.EAP的生化性质与生物学功能(Biochemical properties and biological functions of EAP) 第一个发现的红细胞酶型。 ACP分子量：15-20KD,PI：5-7，广泛分布于 人体各组织，根据ACP在体内分布部位的不 同，可将其分为三类：

  24. 二.等位基因结构与命名(The allelic structure and naming) （一）EAP基因(EAP gene ) 位于人类第 2 号染色体短臂（2p25）， 3个共显性 等位基因： EAP*A、EAP*B、EAP*C。 原因：等位基因EAP*A的第5外显子第24位碱基替换 导致第105位密码子中 A/G改变，是EAP*A 不同于 EAP*B和EAP*C的原因。

  25. （二）EAP表型(EAP Phenotype) 普通表型： 6种 EAP A、EAP B、EAP C、 EAP BA、EAP CA、EAP CB 。 此外，EAP基因座存在稀有等位基因： EAP*D、EAP*E、EAP*F、EAP*G、EAP*R、EAP*0 等。

  26. 三、群体遗传学调查(Population genetics investigation) EAP基因频率的分布有明显的种族差异，各群体 中EAP*B的频率都明显高于EAP*A，其中以黑人EAP*B 的基因频率最高，高达0.9以上，黄 种人EAP*B基因频率介于 黑人和白人之间。 稀有基因EAP*C多见于白种人，黄种人及其他人种尚未检 出或极为罕见。在中国群体中一般只能检出A型、B型和AB型 三种常见的表型，其中B型频率最高，BA型次之，A型最少。

  27. 四.分型方法（typing method） （一）琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等点聚焦 （二）酶显谱反应原理 以4-甲基伞形酮磷酸盐为底物。 4-甲基伞形酮磷酸盐 无荧光性，在 EAP 催化下可分解为 4-甲基伞形酮和 磷酸，4-甲基伞 形酮具有荧光性，在紫外光照射下可 发出荧光。

  28. 复习思考题 • 1.多态性同工酶、酶型的概念。 • 2.酶型的法医学意义。 • 3.EAP分型的原理和方法。

  29. （二）酶谱反应原理(Enzyme reaction principle) ACP 4－甲基伞形酮醋酸盐 羧酸阴离子＋甲基伞形酮 （非荧光物质） （发荧光）

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