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Metodi enzimatici in diagnostica clinica. Enzymatic reaction-based assays. Vantaggi -veloce -molto specifico. Metodi di - Misura in continuo (più facili e più utili) - Misura a tempo fisso. Influenze - pH - temperatura -forza ionica. Michaelis-Menten enzyme kinetics. K m.

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- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
slide2

Enzymatic reaction-based assays

Vantaggi

-veloce

-molto specifico

Metodi di

- Misura in continuo (più facili e più utili)

- Misura a tempo fisso

Influenze

- pH

- temperatura

-forza ionica

slide4

Spesso non è possibile un singolo enzima-reazione sequenziale

Eprim

Eind

B

C

A

X

Y

t ~ 0 [B] << KmB, vind = Vind.[B]/KmB - 1st order reaction

t > 0 k.[Eprim] = Vind

vind = Vind.[B]/(KmB + [B]) = Vind/(KmB/[B] + 1)

[B]  100.KmB - error 1%

It is necessary to use 10 to 100-fold excess of Eind over Eprim!!!

slide5

NAD(P)H assay - Wartburg optical test

A + NADH + H+ B + NAD+

H

H

H

Tutte le deidrogenasi NAD o NADP dipendenti utilizzano queso metodo

test ottico accoppiato
Test ottico accoppiato

A + B C + D

C (oD) +NADH E + NAD+

E’ possibile accoppiare una terza reazione

calcolo attivit enzimatica
Calcolo attività enzimatica
  • 1 UI =1 micromole di substrato trasformato/min = c / min
      • Attività enziamtica (mUI / ml) =

DA V 1000

min e v d

DA = variazione assorbimento a 340

1000 = fattore di conversione alle mUI

V = volume totale della miscela di reazione

e = coeff. Estinzione molare di 1 mmole/ml di NADH a 340

6.22 cm2/mmole

v = volume del campione (ml)

d = cammino ottico (1cm)

slide8

esempi

NH4+

CO2

slide9

NO3-

H2 O2

SO32-

slide11

Ascorbate

578 nm

slide12

Citrate

Malate

Fumarate

Oxalate, Formiate

slide14

Lactate

Pyruvate

2-Oxoglutarate

L-Glutamate

L-Glutamine

slide15

Glucose

Sucrose

Fructose

slide16

Glycerol

Triacylglycerols

Free fatty acids

546 nm

slide17

Cholesterol

405 nm

Bile acids

576 nm

Urea

slide19

NAD(P)H - bioluminescence

h.

(493 nm)

Metodi in luminescenza

ATP - bioluminescence

h.

(562 nm)

diagnostica nell ischemia cardiaca
Diagnostica nell’ischemia cardiaca

Transaminasi glutamico ossalacetica (GOT)

GOT aumenta dopo 6 ore l’infarto

max a 36 ore

livelli normali 5gg

slide21

Creatina fosfato

Fosfocreatina + ADP creatina + ATP

  • Creatina chinasi

Aumenta dopo 3 ore dall’infarto max 24-30 h

livelli normali 3gg

slide22

Lattico deidrogenasi

Aumento entro 2 ore max 60 ore

ritorno alla norma lento

Troponine cardiache:

molto specifiche per il cuore

dosaggio del substrato
Dosaggio del substrato
  • 10 ml di NADH 20 mM (Ci) vengono messi in 2 ml di soluzione tampone (CfNADH = 100 µM)
  • 10 ml di piruvato prelevati dal liquido biologico (siero)
  • 10 ml di lattico deidrogenasi
  • Piruvato + NADH + H+ lattato + NAD+
  • Sapendo che l’e molare di NADH è 6,22 mM-1 cm-1
  • 0,1 mM di NADH avrà un assorbanza di 0,622 (Ai)
  • Nella lettura Af ottengo: 0,322
  • DA = elDC DA = 0,622 – 0,322 = 0.3
  • DC = DA/el = 0.3 / 6,22 mM-1 cm-1 x cm = 0,48 mM = 48 mM
  • Le micromoli di piruvato nei 2 ml della cuvetta saranno uguali a
  • 48 mM x 2 ml / 1000 = 0, 096 mmoli
  • [piruvato] = 0,096 / 10 ml (volume usato) = 9,6 mM (concentrazione del piruvato)