slide1 n.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
Elektromigrační metody PowerPoint Presentation
Download Presentation
Elektromigrační metody

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 28

Elektromigrační metody - PowerPoint PPT Presentation


  • 166 Views
  • Uploaded on

Elektromigrační metody. Separační techniky. Separace je selektivní převod látek mezi fázemi systému, nebo jejich rozdělení v jedné fázi v určitém směru. „Rovnovážné“ – látky jsou převáděny přes fázové rozhraní dostatečně rychle. Separační techniky.

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'Elektromigrační metody' - sadie


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
slide2

Separační techniky

Separace je selektivní převod látek mezi fázemi systému, nebo jejich rozdělení v jedné fázi v určitém směru.

„Rovnovážné“ – látky jsou převáděny přes fázové rozhraní dostatečně rychle

Separační techniky

„Nerovnovážné“ – látky jsou děleny na základě rozdílných rychlostí transportu

slide3

Elektromigrace

Pohyb nabitých částic v kapalném prostředí vyvolaný vložením vnějšího stejnosměrného pole.

Kapalné prostředí musí být vodivé tj. NE deioinizovaná VODA

Elektromigrace = nerovnovážná separační technika

Migrace nabitých částic (iontů, iontových asociátů, nabitých komplexů) v elektrickém poli je možná v roztocích elektrolytů, nejčastěji v PUFRECH

  • Použitý elektrolyt, případně pufr = pracovní elektrolyt (background electrolyte, carrier electrolyte)
  • plní podobnou úlohu jako mobilní fáze v kapalinové chromatografii
  • vyplňuje separační lože
  • na jeho složení závisí úspěšná analýza
  • zajišťuje vodivé spojení celého separačního systému.
slide4

Analytická využitelnost elektromigrace

Nabité částice ve stejnosměrném elektrickém poli se pohybují směrem k opačně nabité elektrodě určitou rychlostí, která je pro nabité částice různých látek různá = tj. tento fakt je možné využít k analytickým i preparativním účelům.

Vedení elektrického proudu v kapalinách (roztocích elektrolytů)

  • V kovech je vedení elektrického proudu zprostředkováno pohybem elektronů (uniformní částice s velmi malou hmotností).
  • V roztocích elektrolytů je vedení elektrického proudu zprostředkováno všemi přítomnými kationty a anionty, přičemž velikost (hmotnost) těchto částic může nabývat malých hodnot (pro solvatované protony až po velké komplexy proteinů nebo polynukleotidů).
slide5

Vedení elektrického proudu je u elektrolytů popisována Ohmovým zákonem

U = I.R

Konduktivita G = 1/R

Kohlrausch – „vodivost roztoku je dána nezávislou migrací iontů“

Katoda

Anoda

-

-

+

+

Při průchodu proudu roztokem elektrolytu migrují anionty směrem k anodě a kationty směrem ke katodě v ekvivalentním moižství nezávisle na sobě. Elektroneutralita roztoku zůstává zachována díky elektrolýze probíhající na obou elektrodách.

slide6

Na obou elektrodách současně probíhá elektrolýza, jejímž výsledkem je produkce protonů na anodě a produkce hydroxoniových iontů na katodě, což zajišťuje zachování elektroneutrality.

Elektrolýzou, ale může dojít ke změně pH pracovního elektrolytu, tzn. s výhodou se využívá pufrů, které tyto změny vyrovnávají a navíc se používají inertní platinové elektrody ve tvaru tenkých drátků, kde dochází k potlačení elektrolýzy (malý povrch elektrody).

slide7

Instrumentace elektromigračních technik

kapilární techniky x plošné techniky

Separace probíhá v kapiláře

Separace probíhá v gelu nebo papíru (podobně jako PC)

+

Zdroj napětí

Pufr

Detektor

Jamky pro vzorky

-

+

-

Gel

Elektrody

Pufr

outlet

inlet

slide8

Instrumentace elektromigračních technik

kapilární techniky x plošné techniky

Separace probíhá v kapiláře

Separace probíhá v gelu nebo papíru (podobně jako PC)

slide9

Instrumentace elektromigračních technik

kapilární techniky x plošné techniky

Separace probíhá v kapiláře

Separace probíhá v gelu nebo papíru (podobně jako PC)

slide10

Plošné i kapilární elektromigrační techniky jsou založeny na stejném principu tj. separace probíhá na základě rozdílných migrací analytů v separačním prostředí, které se ale liší.

Separační prostředí

gelová a papírová

kapilární

  • roztok elektrolytu (pufru)
  • gelové médium + elektrolyt
  • papír + elektrolyt
  • gelové médium + elektrolyt

Separace probíhá v kapiláře (i.d. 25 až 100 m).

Napětí vkládáné mezi elektrody 0 – 30 kV).

Separace malých iontů i makromolekul.

Složitější instrumentace, lepší účinnost separace, snadná detekce, automatizace

Separace probíhá v gelovém prostředí vytvořeném mezi dvěma deskami nebo na papíru

Napětí vkládáné mezi elektrody 0 – 200 V).

Separace pouze makromolekul

Jednoduchá instrumentace, nízká účinnost, nutnost off-line detekce

X

slide11

Mikroseparační technika – Elektroforéza na čipech

„Lab on chip“

Využití nanotechnologií

Celá separace může proběhnout na chipu s křemíkovými kanálky během několika sekund.

slide12

Kapilární elektromigrační techniky

  • Kapilární zónová elektroforéza (CZE)
  • Kapilární izoelektrická fokusace (CIEF)
  • Kapilární gelová elektroforéza (CGE)
  • Kapilární izotachoforéza (CITP)
  • Micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC)
  • Kapilární elektrochromatografie (CEC)

Stejná instrumentace, různé principy separace analytů

slide13

Základní popis elektromigrace, rychlost migrace, mobilita

Katoda

Anoda

-

-

+

+

Do tohoto systému vyplněného roztokem elektrolytu nadávkujeme velmi malou zónu vzorku obsahující ionty.

-

+

+

+

+

+

+

+

IR1

IR2

Situace se změní v případ sériově zapojených odporů

U = IR1 + IR2

slide14

Separace probíhá po vložení stejnosměrného napětí mezi anodu a katodu.

E … intenzita elektrického pole

U... Napětí vkládané mezi elektrody

L…celková délka separačního prostředí (celková délka kapiláry)

L

Katoda

Anoda

-

+

l

l…efektivní délka kapiláry (vzdálenost, kterou analyt urazí při migraci od místa injekce do bodu detekce)

Část L – l se na separaci nepodílí

slide15

Rychlost migrace nabité částice

-

+

+

+

+

t = 0, E = 0

+

+

+

-

+

+

+

+

Fe

Ff

t = t1, E = E1

+

+

+

  • Po vložení napětí mezi elektrody začnou na nabitou částici působit dvě síly, působící navzájem opačně:
  • elektrická Fe
  • odporová, třecí Ff
slide16

Elektrická síla

Odporová síla

Mezi rychlostí pohybu a intenzitou elektrického pole je přímá úměrnost

me…elektroforetická mobilita

tm…migrační čas

slide17

Experimentálně měřenou veličinou je migrační čas tm, ze kterého lze vypočítat pouze tzv. zdánlivou mobilitu μav.

NENÍ tedy fyzikální konstantou 

Výpočet zdánlivé mobility z migračního času

Zdánlivá mobilita je vektorovým součtem efektivní mobility a mobility EOF

Zbavit se všech omezujících závislostí

Limitní (iontová) mobilita mlim = f (T)

Fyzikální konstanta  tabelována

slide18

Jak na to?

  • Měřit při konstantní teplotě
  • Měřit při jednotkové viskozitě (nebo extrapolovat na jednotkovou)
  • Extrapolovat na nulovou iontovou sílu
  • Měřit při 100% disociaci (protonizaci) analytu (a = 1)
  • Eliminovat vliv elektroosmotického toku (změřit mobilitu EOF)

Efektivní mobilita – definovatelná pro slabé elektrolyty a analyty podléhající vedlejším komplexačním nebo asociačním rovnováhám

slabá kyselina

(HA) solv

(H+)solv + (A-)solv

HA

HA

A-

HA

H+

A-

pH

HA

HA

H+

solvent

slide19

Migrovat budou pouze ionty A- směrem k anodě, ale protože disociační rovnováha je velmi rychlá, budou se současně k anodě pohybovat neutrální molekuly HA.

  • Rychlost migrace bude, ale závislá na množství disociovaných molekul HA v pracovním elektrolytu (tj. na stupni disociace).
  • Rychlost migrace (efektivní mobilita) je tím větší, čím je větší stupeň disociace a je maximální pro 100% disociaci (protonizaci)

Elektroforetická mobilita = f (T, pH, viskozity, složení a koncentrace elektrolytu, stupně disociace analytu, vedlejší komplexotvorné rovnováhy apod.)

Analogicky jako pro slabé kyseliny, lze zavést podobnou úvahu i pro slabé báze.

slide20

Praktický důsledek disociačních rovnováh:

Pro migraci v elektrickém poli musí být analyt buď ve formě aniontu nebo kationtu.

pH < 3 – separace kationtů (slabých bazí)

0

Oblast protonizace slabých bazí

pH 3 až 9– separace aniontů i kationtů

pH

pH > 9– separace aniontů (slabých kyselin)

Oblast disociace slabých kyselin

14

slide21

Sekvenace lidského genomu - využití kapilární elektroforézy

Sekvenátor DNA = kapilární elektroforéza s fluorescenční detekcí

Pro dosažení výsledků sekvenace v reálném čase se využívá 96 kapilár najednou a dávkování probíhá z mikrotitrační destičky

slide23

Pro elektroforetickou separaci je nutné, aby analyty byly nabité (anionty, kationty, komplexy nebo asociáty s výsledným nenulovým nábojem).

Neutrální (a hydrofobní) analyty lze separovat elektroforeticky, pomocí micelární fáze.

Všechny elektromigrační metody umožní pouze separaci analytů, ale neumožní detekci, tj. podobně jako u chromatografických metody je nutno zařadit detektor pro detekci separovaných analytů.

On-line detekce

Kapilární elektromigrační metody

Off-line detekce

On-line detekce = detekce probíhá na místě před koncem kapiláry (různá celková délka kapiláry a efektivní délka kapiláry)

L

Katoda

Anoda

-

+

l

Detekční okénko

slide24

Separační prostředí v kapilárních technikách

  • Křemenná kapilára – vyrobená z taveného křemene (nejčastěji používaná)
  • Teflonová kapilára – vyrobená z teflonu

Křemenná kapilára – nejčastěji 25 až 100 mm vnitřní průměr, vnější průměr 375 mm. Pro snadnou manipulaci a snadný odvod tepla generovaného průchodem proudu uvnitř kapiláry je kapiláry pokryta polyimidem. Délka v desítkách cm až do 1 m.

Pro on-line detekci je někdy nutné odstranit vrstvu polyimidu, tak aby mohl vzniklým detekčním okénkem procházet např. paprsek UV-Vis, nebo fluorescenčního záření.

Pro on-line vodivostní detekci není nutné polyimid odstraňovat.

V případě teflonové kapiláry není nutné vytvářet detekční okénko (teflon je UV-Vis transparentní).

slide25

Nejčastější typy detekcí

  • UV-Vis (DAD) detekce
  • Fluorescenční detekce
  • Vodivostní detekce
  • Hmotnostní spektrometrie
  • Ampérometrická detekce
  • Radiometrická detekce
  • NMR, cirkulární dichroismus, refraktometrie, IR spektrometrie

Nejčastěji využívané detekce

Detekci je nutné zvolit podle typu analytu, podle množství informací, které je možné danou detekcí získat, podle náročnosti instrumentace, ceny apod.

Absolutně nejčastěji je CE spojována s UV-Vis (Detektor diodového pole, DAD) detektorem

slide26

Schématické možnosti spojení CE technik s ostatními separačními a detekčními technikami

slide27

Detektor diodového pole – diode array detector

Seskupení několika tisíc fotodiod, které úplně pokrývají vymezený interval vlnových délek. Foton po dopadu na fotodiodu vyvolá fotoelektrický proud. Tento proud vybije kondenzátor, se kterým je dioda spojena. Měří se proud, který je nutný na opětné dobití kondezátoru. Vyhodnocení signálů provádí počítač.

DAD detektor umožňuje snímat signál při jedné nebo několika vybraných vlnových délkách a navíc ukládá do paměti absorpční spektrum detekovaného analytu.

Podobný výstup má i tzv. CCD detektor (Charge Coupled Device – CCD) – snímač s nábojovou vazbou.

Schéma DAD detektoru

3D záznam (t, A, λ)