basistechnieken van de recombinant dna technologie n.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie PowerPoint Presentation
Download Presentation
basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 47

basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie - PowerPoint PPT Presentation


  • 125 Views
  • Uploaded on

basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie. Deel 1. door Peter Roels Monitoraat Wetenschappen K.U. Leuven. basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie. DNA-dubbelhelix inleiding: 3 pijlers restrictiefragment-lengtepolymorfisme Southern-vlektechniek genkloning

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie' - richelle-lucas


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
basistechnieken van de recombinant dna technologie

basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

Deel 1

door Peter Roels

Monitoraat Wetenschappen

K.U. Leuven

slide2

basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

  • DNA-dubbelhelix
  • inleiding: 3 pijlers
  • restrictiefragment-lengtepolymorfisme
  • Southern-vlektechniek
  • genkloning
  • polymerase-kettingreactie
  • DNA-sequentiebepaling

DNA! Natuurlijk, maar...

slide3

basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

  • DNA-dubbelhelix
  • inleiding: 3 pijlers
  • restrictiefragment-lengtepolymorfisme
  • Southern-vlektechniek
  • genkloning
  • polymerase-kettingreactie
  • DNA-sequentiebepaling

DNA! Natuurlijk, maar...

dna dubbelhelix
DNA-dubbelhelix

DNA! Natuurlijk, maar...

dna dubbelhelix1
DNA-dubbelhelix

5’ TGA 3’

3’ ACT 5’

DNA! Natuurlijk, maar...

slide6

basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

  • DNA-dubbelhelix
  • inleiding: 3 pijlers
  • restrictiefragment-lengtepolymorfisme
  • Southern-vlektechniek
  • genkloning
  • polymerase-kettingreactie
  • DNA-sequentiebepaling

DNA! Natuurlijk, maar...

3 pijlers in de recombinant dna technologie
3 pijlers in derecombinant-DNA-technologie
  • complementaire basenparing
  • restrictie-enzym of restrictie-endonuclease
  • DNA-polymerase

DNA! Natuurlijk, maar...

complementaire basenparing
complementaire basenparing

steeds:

adenine – thymine

(2 H-bruggen)

guanine – cytosine

(3 H-bruggen)

van groot belang in biologische werking, o.a.:

  • DNA-replicatie
  • RNA-synthese

cruciaal in vele technieken!

DNA! Natuurlijk, maar...

complementaire basenparing1

absorbantie

es DNA

DENATURATIE

ds DNA

temperatuur

complementaire basenparing

DNA! Natuurlijk, maar...

complementaire basenparing2

absorbantie

Ts

temperatuur

complementaire basenparing

DNA! Natuurlijk, maar...

complementaire basenparing3

GC-gehalte

absorbantie

<Ts

< Ts

Ts

temperatuur

complementaire basenparing

DNA! Natuurlijk, maar...

complementaire basenparing4

absorbantie

temperatuur

complementaire basenparing

es DNA

RENATURATIE

ds DNA

DNA! Natuurlijk, maar...

complementaire basenparing5
complementaire basenparing
  • ook tussen niet perfect complementaire strengen is renaturatie (hybridisatie) mogelijk
  • algemene regel:

- smelttemperatuur van deze dubbelhelix lager naarmate aantal complementaire basen afneemt

- hoe meer de strengen complementair aan elkaar, hoe hoger de temperatuur van het medium vóór denaturatie

DNA! Natuurlijk, maar...

restrictie enzymen
restrictie-enzymen
  • herkent en knipt welbepaalde sequentie van nucleotiden (4 tot 8 bp)
  • herkenningssequentie is palindroom

5’...GAATTC...3’

3’...CTTAAG...5’

DNA! Natuurlijk, maar...

restrictie enzymen1

...G AATTC...

...CTTAA G...

restrictie-enzymen
  • herkent en knipt welbepaalde sequentie van nucleotiden (4 tot 8 bp)
  • herkenningssequentie is palindroom

vaak met vorming “kleverige eindjes”

5’...GAATTC...3’

3’...CTTAAG...5’

DNA! Natuurlijk, maar...

dna polymerase
DNA-polymerase
  • maakt vanaf aparte nucleotiden DNA-streng aan op enkelstrengse matrijs
  • steeds dubbelstrengs DNA nodig als start
  • steeds aangroei nieuwe DNA-streng aan

3’-uiteinde

3’...CTTAAG... 5’

5’...GA 3’

DNA! Natuurlijk, maar...

dna polymerase1
DNA-polymerase
  • maakt vanaf aparte nucleotiden DNA-streng aan op enkelstrengse matrijs
  • steeds dubbelstrengs DNA nodig als start
  • steeds aangroei nieuwe DNA-streng aan

3’-uiteinde

3’...CTTAAG... 5’

5’...GA 3’

ATTC...

DNA! Natuurlijk, maar...

slide18

basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

  • DNA-dubbelhelix
  • inleiding: 3 pijlers
  • restrictiefragment-lengtepolymorfisme
  • Southern-vlektechniek
  • genkloning
  • polymerase-kettingreactie
  • DNA-sequentiebepaling

DNA! Natuurlijk, maar...

restrictiefragment lengtepolymorfisme rflp
restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP)
  • digestie van DNA met restrictie-enzym

DNA! Natuurlijk, maar...

restrictiefragment lengtepolymorfisme rflp1
restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP)
  • digestie van DNA met restrictie-enzym

DNA! Natuurlijk, maar...

restrictiefragment lengtepolymorfisme rflp2
restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP)
  • digestie van DNA met restrictie-enzym

DNA! Natuurlijk, maar...

restrictiefragment lengtepolymorfisme rflp3
restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP)
  • digestie van DNA met restrictie-enzym
  • gelelektroforese (met agarosegel)

DNA! Natuurlijk, maar...

slide23

gelelektroforese: opzet stalen

1 2 3 

DNA! Natuurlijk, maar...

slide24

gelelektroforese: opzet stalen

1 2 3 

DNA! Natuurlijk, maar...

slide25

gelelektroforese: spanning

-

+

DNA! Natuurlijk, maar...

slide26

gelelektroforese: spanning

-

+

DNA! Natuurlijk, maar...

slide27

gelelektroforese: spanning

-

+

DNA! Natuurlijk, maar...

slide28

1000

500

300

200

100

gelelektroforese: visualisatie

-

+

DNA! Natuurlijk, maar...

slide29

gelelektroforese: visualisatie

-

+

DNA! Natuurlijk, maar...

restrictiefragment lengtepolymorfisme rflp4
restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP)
  • digestie van DNA met restrictie-enzym
  • gelelektroforese (met agarosegel)
  • interpretatie

DNA! Natuurlijk, maar...

slide31

gelelektroforese: interpretatie

1 2 3 

400

50

DNA! Natuurlijk, maar...

slide32

5’…CAATT 3’

3’…G 5’

5’…CAATTG…3’

3’…GTTAAC…5’

5’…CAACTG…3’

3’…GTTGAC…5’

5’ G…3’

3’ TTAAC…5’

gelelektroforese: interpretatie

1 2 3 

400

50

DNA! Natuurlijk, maar...

slide33

gelelektroforese: interpretatie

1 2 3 

400

50

DNA! Natuurlijk, maar...

slide34

5’…CGGTCTAGGTG…3’

3’…GCCAGATCCAC…5’

5’…CGGGGTG…3’

3’…GCCCCAC…5’

gelelektroforese: interpretatie

1 2 3 

400

50

5’…CGGTCTAGGTG…3’

3’…GCCAGATCCAC…5’

DNA! Natuurlijk, maar...

slide35

gelelektroforese: interpretatie

1 2 3 

400

50

DNA! Natuurlijk, maar...

slide36

gelelektroforese: interpretatie

1 2 3 

400

50

DNA! Natuurlijk, maar...

resultaat na digestie van totaal genomisch dna
resultaat na digestie van totaal genomisch DNA

1 2 3 

400

50

DNA! Natuurlijk, maar...

slide38

basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

  • DNA-dubbelhelix
  • inleiding: 3 pijlers
  • restrictiefragment-lengtepolymorfisme
  • Southern-vlektechniek
  • genkloning
  • polymerase-kettingreactie
  • DNA-sequentiebepaling

DNA! Natuurlijk, maar...

southern vlektechniek

agarosegel

nylondrager

autoradiogram

5’…AACTCAGCTG … 3’

blotting

+ sonde

radiografie

5’ … AACTC 3’

3’ GAGTCG 5’

5’ AGCTG … 3’

3’ GAGTCG 5’

Southern-vlektechniek

3’ GAGTCG 5’

DNA! Natuurlijk, maar...

southern vlektechniek afkomst sonde probe
Southern-vlektechniek:afkomst sonde (probe)
  • uit gekende aminozuursequentie van eiwit (degeneratie code!)
  • uit mRNA, na omzetting in cDNA
  • sonde gebruikt in een ander, verwant organisme (voldoende complementair!)

DNA! Natuurlijk, maar...

slide41

basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

  • DNA-dubbelhelix
  • inleiding: 3 pijlers
  • restrictiefragment-lengtepolymorfisme
  • Southern-vlektechniek
  • genkloning
  • polymerase-kettingreactie
  • DNA-sequentiebepaling

DNA! Natuurlijk, maar...

genkloning specifieke amplicatie van dna fragment

5’ GAATTC 3’

3’ CTTAAG 5’

lacZ-gen (enzym katalyseert

omzetting “X-gal” naar blauwe

kleurstof)

ampicillineresistentiegen

genkloningspecifieke amplicatie van DNA-fragment

pUC18

DNA! Natuurlijk, maar...

genkloning specifieke amplicatie van dna fragment1

5’ GAATTC 3’

3’ CTTAAG 5’

genkloningspecifieke amplicatie van DNA-fragment

5’ GAATTC GAATTC 3’

3’ CTTAAG CTTAAG 5’

DNA! Natuurlijk, maar...

genkloning specifieke amplicatie van dna fragment2

5’ GAATTC GAATTC3’

3’ CTTAAG CTTAAG5’

5’ GAATTC 3’

3’ CTTAAG 5’

GAATTC

CTTAAG

GAATTC

CTTAAG

genkloningspecifieke amplicatie van DNA-fragment

DNA! Natuurlijk, maar...

genkloning specifieke amplicatie van dna fragment3

+ ampicilline

+ X-gal

bacterie – plasmide = niet-AB-resistent

plasmide zonder donor-DNA = blauw

genkloningspecifieke amplicatie van DNA-fragment

DNA! Natuurlijk, maar...