140 likes | 385 Views
Protein Isolation and Amino acid sequencing. Determination of Primary Structure. 1. หาปริมาณโปรตีนจากตัวอย่าง 2. แยกและทำโปรตีนให้บริสุทธิ์ 3. ตรวจสอบกรดอะมิโนที่เป็นองค์ประกอบทั้งหมดและน้ำหนักโมเลกุล 4. S-S--->-SH 5. ตรวจชนิดกรดอะมิโนที่ปลาย N- และ C-.
E N D
Determination of Primary Structure 1. หาปริมาณโปรตีนจากตัวอย่าง 2. แยกและทำโปรตีนให้บริสุทธิ์ 3. ตรวจสอบกรดอะมิโนที่เป็นองค์ประกอบทั้งหมดและน้ำหนักโมเลกุล 4. S-S--->-SH 5. ตรวจชนิดกรดอะมิโนที่ปลาย N- และ C-
Determination of Primary Structure 6. ย่อยโปรตีนเป็นส่วน ๆ แยกแต่ละส่วนออกจากกัน 7. หาลำดับกรดอะมิโนในแต่ละส่วน ดูส่วนที่ overlap เพื่อการเรียงลำดับ
การหาปริมาณโปรตีน 1. วัด Absorbancy ที่ 280 nm 2. Biuret reaction (580 nm) 3. Lowry’s method (700 nm) 4. Coomassie brilliant blue
การแยกโปรตีน 1. คุณสมบัติทางประจุ: electrophoresis, ion exchange chromatography 2. คุณสมบัติในการละลาย : pI, neutral salt, organic solvent, complex anions, heavy metal cations 3. คุณสมบัติขนาดของโมเลกุล : gel filtration, SDS-PAGE, ultrafiltration, ultracentrifugation 4. คุณสมบัติเฉพาะตัว: affinity chromatography
Amino acid sequencing 1. หาน้ำหนักโมเลกุล : Gel filtration, SDS-PAGE 2. ตรวจสอบชนิดกรดอะมิโนที่ปลาย N- -2,4-dinitofluorobenzene (DNF), pH 8 -Dansyl chloride, pH 10 -Edman degradation
ตรวจกรดอะมิโนที่ปลาย N- (dansyl chloride)
Amino acid sequencing 3. ตรวจสอบชนิดกรดอะมิโนที่ปลาย C- -carboxypeptidase -enzymes
Amino acid sequencing 4. วิเคราะห์หาส่วนประกอบทั้งหมดของโปรตีน โปรตีน + 6N HCl----> hydrolysis Amino acid analyzer หลักการของ ion-exchange chromatography (fig 4.8)