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各種疾病的分子基礎

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各種疾病的分子基礎. 多基因突變的檢測方法 反向斑點雜交 ( Reverse dot hybridization) 對突變的基因型設計該突變基因型特異的寡核苷酸 ( allele specific oligonucleotide, ASO) 探針來進行檢測 ASO 一般使用約 20 bp 長的寡核苷酸,利用一條與正常序列相同及一條與突變者相同的寡核苷酸 用放射線或螢光物質標示寡核苷酸,分別與 PCR 產物做雜交反應,只有完全相同序列的寡核苷酸才能與待測 PCR 產物雜交,才會會顯示訊 號 只要有一個鹼基錯配,就不會雜交

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Presentation Transcript
slide1
各種疾病的分子基礎
  • 多基因突變的檢測方法
    • 反向斑點雜交( Reverse dot hybridization)
      • 對突變的基因型設計該突變基因型特異的寡核苷酸( allele specific oligonucleotide, ASO)探針來進行檢測
      • ASO一般使用約20 bp長的寡核苷酸,利用一條與正常序列相同及一條與突變者相同的寡核苷酸
      • 用放射線或螢光物質標示寡核苷酸,分別與PCR產物做雜交反應,只有完全相同序列的寡核苷酸才能與待測PCR產物雜交,才會會顯示訊 號
      • 只要有一個鹼基錯配,就不會雜交
      • dot blotting是直接將樣本固定在NC paper上,然後進行ASO雜交,不像Southern blotting必須先跑電泳分開
      • 依據不一樣的寡核苷酸的探針位置,就可以偵測不相同基 因或不相同位點的突變
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毛細管電泳( capillary electrophoresis, CE )
    • 現在自動定序儀的基本原理
  • RT-PCR
    • PCR以DNA為模板,不能以RNA為模板
      • 因RNA 太不穩定
      • 到處充滿RNase,會將RNA水解
    • 先將RNA反轉錄成DNA
    • mRNA都帶有poly A tail,利用此特性把 mRNA分離出來
    • 分離出來的mRNA,在reverse transeriptase (RT)的作用下形成第一股cDNA
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一般使用的RT有二個來源
    • 禽骨髓細胞瘤病毒Avian myeloblastoma virus (AMV)
    • 鼠白血病病毒Moloney murine leukemia virus (Mo-MLV)
    • 純化的AMV-RT由二條鍵組成,具有primer-dependent聚合酶活性,最適溫度5‘→3’是42°C
    • 較強RNase H的活性使cDNA的產量下降也限制了長度
    • 可將RNA-DNA雜合體 (RNA-DNA heteroduplex product)的RNA水解
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Mo-MLV為單鍵,具有RNA聚合酶活性,最適溫度為37°CMo-MLV為單鍵,具有RNA聚合酶活性,最適溫度為37°C
  • 較弱RNase H活性,可以得到較長的cDNA
  • 但是作用溫度較低,無法消除mRNA的二級結構,不利RT-PCR的進行
  • RT是一種primer-dependent聚合酶
    • 需mRNA當模板
    • primer來做5’→3’的引子延伸
    • 引子有:gene-specific primer、oligo (dT) primer、random hexamer primer
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gene-specific primer:
    • 將目標RNA或相同保留序列的mRNA家族合成第一股cDNA
  • oligo (dT)primer
    • 與mRNA 3端的poly (A)結合,須通過3’UTR(untranslation region)才能到達coding區域,mRNA愈長,要得到全長的cDNA就越困難
  • 6聚寡核苷酸隨機引子
    • cDNA第一股合成會從不同的mRNA 位置開始
    • 可得到大、小不等的cDNA,coding區域及5‘端序列也可
    • 適合長mRNA或有複雜二級結構的mRNA
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RNA display, Differential display-PCR (DD-PCR)
    • 1992 Liang、Pardee和Welsh 使用PCR的方法,將mRNA以cDNA的方式呈現出來的方法稱RNA display (Differential display-PCR)
    • 可快速且同時將不同的細胞的mRNAs呈現出來比較
    • 不同的細胞,有不同的mRNA表現,即所謂的組織特異性( Tissue Specific)
    • 比較不同細胞的表現基因,就可以知道哪些基因被表現或被關掉
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Differential display的主要步驟
    • 設計一個含有大約12個T及鄰接T的二個任意鹼基(T除外)的antisense primer,在RT的作用下,合成第一股cDNA
    • 設計一條約10鹼基的random primer做PCR的擴增
    • PCR產物跑denaturing polyacrylamide gel及自動顯影,比較跑出來的patterns
    • 將差異的地方再以PCR擴增下來做cloning及sequencing
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第一股cDNA 的合成是使用12個dT,鄰接T的最後二個鹼基NM做排列組合有
    • AA,AG,AC,GA,GG,GC,CA,CG,CC,TA,TG,TC共有12種組合
    • 使用修飾過的3‘-oligo-dT primer將一小部分的mRNA 擴增下來比較分析
    • 使用12種組合中的一種,理論上來講只有全部 mRNA的1/12會被擴增下來
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5'-random primer
    • 此技術的限制是PCR產物的分離,因定序膠大於500 bp時就不能分辨
    • 注意事項
      • :長度設計在10 bp, AT和GC的含量相同,no dimer or stem-loop
      • random primer的5‘端前二個bp設計成GC或CG可以產生最高數目的 PCR產物,在3’端設計成G也可
      • 較長的5 ‘-random primer (25-28 mers), 增加DD-PCR的再現性( reproducibility), 也降低了膠上的band數目
      • 愈長的引子Annealing的溫度就要愈高,增加了引子的特異性
      • dNTP的濃度降到2 mM時會增加DD-PCR的特異性,一般標準的PCR dNTP濃度是 200 mM
      • 低dNTP濃度下,有利於具放射性的 dATP插入引子的複製延伸中
      • 以1 kb需要60 sec而言, DD-PCR (extension)限制在30 sec
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DD-PCR好處
      • 不同的基因表現型式可以很快在同一片膠上比較出來
      • 可以將不同的或差異的條帶切下來,做進一步的選殖和定序
      • 實驗的結果重複做再現性高
      • 較其它傳統方法更快速又簡單
  • 基因晶片DNA chip 、Gene chip 、DNA microarray
    • 基因體解碼的後基因時代,龐大資料,單靠簡單的分生技術實難分析
      • 生物資訊學的發展
      • 基因晶片的大量分析技術
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高密度的寡核苷酸微陣列( oligo chip)
    • 將特定已知約20 bp的寡核苷酸點在基板上
    • 每一點都是不一樣的DNA序列
    • 將一個基因的可能突變序列都點在一片晶片上
    • 待測的DNA做標記,與晶片的probe雜交
    • 以雷射共聚焦顯微掃描器,對雜交信號進行判讀,可以作為診斷及(定序?)
  • DNA chip
    • 將一個基因的片段(約120 bp)點一點
    • 一個小小晶片上可點數萬點
    • 可將人類大約2萬多個基因全部點在一片晶片
    • 可研究基因表現的差異
      • 把不同來源的mRNA, 反轉錄成cDNA並且使用不同顏色的螢光來標記
      • 與晶片雜交,可比較差異或量上的變化
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基因晶片的基本原理及應用
    • 基本原理
      • 反向斑點雜交( reverse dot blot analysis)
        • 探針分子固定在基板上,探針的為cDNA或 genomic DNA的PCR 產物或是合成的寡核苷酸
        • 美國Affymetrix公司使用光照原位合成( in situ synthesis)
      • 比較基因組雜交( comparative genome hybridization, CGH )
        • 1992年Kallioniemi 等人所發展出來
        • 使用二種不同的螢光顏色分別標記待測DNA及正常對照組DNA樣本,二者混合後與正常中期的染色體雜交,最後根據兩種探針在雜交區域螢光顏色的強度比,進行基因(缺失、重複、擴增)量的分析
slide17
利用的fiber optic bundles及beads,或合併flow cytometey等方法
    • 基因分型( genotyping )
      • 定序已知重要的基因,如抑癌基因P53、BRCAI或遺傳疾病cystic fibrosis等,以發現突變所在
      • 偵測臨床上有重要功能的基因型,如將所有藥物代謝有關的基因及其變異型組合成一晶片來預測病人服藥後的代謝情形,或避免藥物的不良反應,或決定藥物的劑量等
      • 偵測基因體內所有鹼基的點變異single nucleotide polymorphism (SNP) ,此種晶片可用於疾病基因的關聯性分析,親子鑑定,人種的遷移等,可取代過去利用microsatellite (STR)的分析方法。
slide18
基因表現( gene expression)相關的研究
    • 偵測生物體(所有)mRNA的表現情形
    • 身體地圖( body maps) ,利 用整個基因體mRNA的表現晶片分析全身各種組織的所有mRNA表現,了解組織特異性及非特異性基因,了解它們的調控情形及受外來因素的影響的異同
    • 藥物影響組織的基因表現差異性; 罹病狀態與正常的差異,如癌細胞與正常細胞的差異,糖尿病與非糖尿病的基因表現差異等
    • 剖析各種代謝或訊息 傳導等相關途徑,如經由某些代謝或訊息傳導等相關基因突變或表現量的改變,利用mRNA表現晶片來探討它們對於相關途徑的有關基因影響及整個表現基因體的影響
    • 探討生物體受環境變化的影響,如藥物的作用,溫度的變化‘pH的變化等
    • 探討生物體發育生長的變化,如由單一受精卵細胞分裂成二個、四個...等細胞時, 基因表現的差異
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探討另類剪接或發現exon
    • 可利用含有所有基因的exon晶片,來探討各個組織每個基因的exon利用情形,因而可了解是否有另類剪接( alternative splicing)
    • 每30個鹼基或更多,就設計一個60 bp的probe,涵蓋整個基因體或某一條染色體,在與不同組織的RNA反應,依據其反應的結果就可推測exon及intron 所在,及是否有組織特異的另類剪接
  • 探討non-coding RNA
    • 基因體中,有一些序列轉錄後並不會被轉譯成蛋白質,此轉錄後的RNA稱non-coding RNA ,可能具有調控其它基因表現的功能,如micro RNA可抑制其target genes的表現,因此利用 micro RNA的晶片可探討micro RNA在生物體發育,生長疾病狀態...等扮演的角色。
slide20
探討病原體及其特性
    • 偵測未知檢體是否有病原體存在,因此晶片上可放入各種不同的病原體DNA系列經由反 應後,即可了解病原體為何
    • 偵測病原體的特性,如抗藥性,對宿主的影響相關因子等
  • 探討起動子(promoter)甲基化
    • 基因起動子的甲基化會造成該基因的不活化,因此經由整個基因體起動子甲基化晶片的研究,即可了解 基因活化的狀態及其意義
  • 探討染色體上基因或DNA片斷的增多或減少
    • 過去可利用CGH的方法來偵測染色體上DNA片斷的增多或減少
    • 目前已有晶片含有人類所有的DNA片斷,經由反應後,即可了解在染色體上那部分有增多或減少
    • 也有晶片含有固定copy數人類所有基因,經由反應後即可了解基因 copy數的變化。
slide21
檢測DNA量變化的方法
    • 絕對定量( absolute quantitation)方面,主要是應用於病毒及病原菌的偵測,必須有已知濃度的標準樣品,利用這種已知濃度的樣品與受檢的樣品比較就可以得知
    • 相對定量( relative quantitation )方面,藉由一 個在組織表現量穩定的基因(例如: 1的rRNA, GAPDH, B-actin....等)來比較待測基因量相對的變化,這個方法廣泛應用於基因量表現的研究
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PCR方法在量分析存在的一些問題
    • PCR的動力學
      • PCR產物一開始並不是呈指數增加,在後面的回數甚至沒有量的變化,只有在指數增加期才能在量方面有變化上的意義
      • PCR的整個動力學可以分成三個階段
        • 早期階段(E) 在初期回數裹,因為PCR產物量太少,無法精確地偵測到每個cycle所產 生訊息強度的變化
        • 指數增加期(M) 當cycle數到某一數目以後,所產生的每一cycle的變化,就可精確偵測出 訊息強度的變化,這個時期的PCR產物是呈指數累積
        • 高原期(L) 一隨著反應回數的增加,必定會消耗反應的成分或增加了抑制PCR反應的作 用,所以在這個時期並沒有量的增加
slide24
影響PCR定量的原因
    • PCR高原期沒有量的變化,原因是因為產物濃度逐漸上升,有限的受質及Taq被漸漸消耗掉,造成反應產物不再增加
    • 不同來源的檢體,每一次PCR所呈現的動態反應不一致
    • 抑制劑污染,會影響PCR的反應效率
    • 不同的PCR機器有效率上的差異
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以PCR為基礎發展出評估量變化的方法
    • Quantitative competitive PCR
    • 要克服每一次動態反應不一致的問題可以使用Competitor PCR
      • PCR反應液裡再加入定量的參考RNA或DNA,而且與目標序列是使用同一組primer
      • 使用同一組primer理論上來講, PCR的效率、目標序列與參考序列應該是一樣
      • 做一系列的濃度稀釋,加入待測的目標樣本,然後各跑PCR,每 一管的濃度差異越小更能正確反應目標DNA的濃度變化
      • 因參考的序列濃度已知,只要找在電泳照片上亮度一樣的條帶就表示濃度一樣。
      • 因參考的量已知,目標序列的量變化就可以比較出來
      • 事實上Competitor與目標DNA的效率也不是一樣,二者是競爭關係,導致結果的量與原模板的量被高估或低估,並不能真正反應正確量的變化
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基因的表現在mRNA層次上,才有量的變化
    • 有些疾病或腫瘤有基因的缺失或基因被擴增,如單套體或三套體,基因的DNA複本數有改變時就是所謂的gene dosage分析
    • 也可使用quantitative competitor PCR的方法來擴增DNA上基因複本數的變化
  • semi-quantitative RT-PCR半定量方法
    • 藉由偵測指數期量的變化,可得知樣本mRNA量的變化或提供一個相對的變化
    • 在PCR的指數增加期,分別將樣本所產生的PCR 產物取出跑電泳分析,就可分辨
    • 須要一個不會有量變化的基因,當控制組
    • 基因表現差異很大時才容易分辨出來,最重要是必須重複做,保證實驗結果的一致性及再現性
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Real-time quantitative PCR
    • PCR的基礎上加上螢光檢測技術
    • 螢光定量的基礎:螢光強度在一定範圍內是與螢光物的濃度成正比
    • DNA binding dye
      • ethidium bromide可由UV偵測
      • SYBR Green I及 SYBR Gold
      • 只要有雙股DNA合成就可定量,不必合成primer,壞處是非特異性的雙股產物也會被黏上,也會有螢光反應,結果就不正確
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解鏈曲線分析 ( melting-curve analysis)
    • 達到雙股DNA的Tm值時,因為雙股鏈分開,會降低DNA binding dye的信號強度,可以利用這種方法來偵測單一鹼基的突變
    • Single-nucleotide polymorphisms (SNPs)
      • 設計二個 Allele-specific引子,分別只跟特定的Allele黏上
      • Anti-sense primer設計成兩個Allele都適合的引子
      • PCR時會有Homozygous及Heterozygous的產物產生
      • 更區別Tm值的不同,將其中一個引子,在5'端多加一個GC尾巴,做PCR時能同步偵測Tm值的不同,而分析出不同的基因型
slide32
螢光淬滅及螢光共振能量轉移
    • 螢光淬滅是指會引起螢光物質螢光強度消滅的過程,引起整個過程的物質就是淬滅劑( Quencher ) ,一般使用的螢光物質與淬滅劑在50Ẵ內會抑制螢光的產生,這個結構被破壞時螢光物就不會受抑制而有螢光產生
    • 螢光共振能量轉移,就是利用二個靠近的螢光物質,會發生能量轉移,經由轉移能量的大小來做為定量的依據
slide33
TaqMan系統
    • 利用Tag DNA polymerase的5‘3’外切酶的活性
      • 先合成一個probe 5端帶一個螢光染料作為報告者( Reporter) ,3端帶一抑制者的螢光染料(Quencher)
      • Reporter跟 Quencher二個靠在一起就不會有螢光放射出來,也就是沒有信號可以偵測
      • probe是設計在要偵測的DNA序列中,做PCR時,與序列雜交的probe會被5‘ →3’外切酶切掉
      • Reporter 沒有Quencher的抑制下,PCR產物增加,信號也增強,就可做量的分析
      • 也可使用多種螢光染料,同時偵測不同的PCR產物( Multiplex PCR)
      • 很類似PCR-ASO,加入一特異性的probe更增加特異性,同時有定性及定量
      • 靠近5端引子小於150 bp,效率及再現性都會較好
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FRET系統Foster resonance energy transfer through space
    • 利用Annealing的階段,使用二個鄰近的probe各帶有一個螢光成分,
    • 一個探針的3‘端是能量提供者(donor) ,另一探針的5’端是能量接受者(acceptor)
    • 當螢光成分靠在一起時,發生能量轉移,會有螢光 信號產生出來
    • PCR產物越多的時候,二個probe在Annealing階段黏上單股DNA的情形就越多,能量轉移就愈好,當然所放射出來的強度就越強
    • 缺點
      • 要設計二個相鄰probe,範圍大約1-5 bp
    • 使用這種方法來做SNP分型
      • probe與它的互補序列完全互補上時它的Tm值會高於mismath
      • 將SNP 的位置設計在一個probe的中間,藉由偵測Tm改變(相差5-8°C左右),就可加以分型
slide39
分子信標molecular beacons
    • 為一個髮夾式的結構,環狀的部分與目標序列互補
    • 臂的部分形成自身鏈內的互補
    • 夾子的5‘端含有一個Reporter螢光團和3’端 Quencher螢光團
    • 當形成髮夾結構時沒有螢光產生,也就是二個靠在一起就沒有可偵測的螢光產生
    • 當環狀部分與目標序列雜交後,髮夾結構就會展開, 這時Reporter因為沒有Quencher的抑制作用所以會發出螢光
    • 缺點:除了考慮probe與模板的Tm 值外,還須考慮自身鏈內互補 結構的Tm值
slide40

分子信標的缺點時除了考慮probe與模板的Tm 值外,還必須考慮自身鏈內互補 結構的Tm{宜

slide41
定量PCR討論
    • 2002年發生於中國廣東的SARS冠狀病毒的確認
    • 1981年得知HIV病毒的存在,1984年才確認感染的病毒
    • 因PCR技術的成熟,短短數週的時間就將整個病毒確認及定序完成
    • 基因的比對中,確定宿主是果子狸
    • PCR非常靈敏,然而影響PCR的效率也有很多因素
      • Mgl2的濃度,各種不同的抑制劑,及primer本身及濃度問題....等
      • 檢體DNA及RNA的萃取也是非常重要
slide42
量的分析
    • 因PCR是以DNA為材料的方法,所以必須將有 量變化的RNA反轉錄成cDNA
      • 因為RNA隨時都會被破壞很不穩定
      • 檢體必須新鮮乾淨,盡快將RNA萃取出來,反轉錄成Cdna
    • cDNA的量要真正能反應樣本原來RNA的量
      • 實際上不能將原本樣本的RNA百分百反轉錄成Cdna
      • 做RT-PCR時的reverse transcription階 段,好的RT就很重要
      • 有時樣本待測的目標序列複本數少時,更高靈敏度及特異性的RT才能偵測出來
      • 以SARS為例: 發病一、二天的喉頭檢體病毒量很少時,因為檢體試劑的敏感度及特異性問題可能會產生false-negative,所以產生了SARS的(初期發病?)階段RT-PCR的偽陰性反應
slide43
理論上只要十幾、二十幾個病毒量(copy number)就應該可以偵測出來
  • 但因反轉錄成cDNA受某些因素影響不能達到百分之百的效率
  • 一般都必須等到發病後一星期左右才能偵測出來
  • 如何提高發病早期偵測 病毒的靈敏度,這在控制病毒傳播上是非常重要
  • Real-time PCR按照“閥值(Ct) ”的概念,利用反應進入指數增加期的閥值做為定量的標準,機器本身的再現性及靈敏度較高
slide45
量分析的標準化
    • 定量PCR時,在指數增加期才有量變化上的意義
    • 此時螢光強度與模板股的複本數成正比
    • 做一系列濃度稀釋的圖形
      • 可做5倍或10倍稀釋,因為含量都是已知,所有的condition都一致,而且標準樣本與待測樣本的PCR效率也一樣,螢光強度就與樣本的濃度成正比
slide48
量分析的修正
    • 反應條件下都一樣的情況下,只要做一系列已知濃度稀釋的標準圖形,我們就可以利用標準圖形,得知待測目標序列相對的量變化
    • 但樣本RNA的萃取在RNA含量及含量純化方面,再現性有問題
    • PCR的擴增情形並不是就反應樣本中RNA的其實情況
      • 有些RNA的成員可能被擴大,而複本數少的RNA可能又被忽略
      • 每一次做PCR效率可能都不 一樣
      • 管與管之間的效率也會有差異
      • 每次取的量也可能有誤差
    • 必須加內標加以校正,這樣前後量的變化就不會因為各種因素的影響,而使結果不能分析
    • 內標的存在可以減少污染導致的偽陽性或偽陰性
slide49
校準的方法
    • Competitor
      • 在試管內合成一段與待測序列使用同組引子,有相同效率且量是已知的序列,加入待測基因裡面,做為參考校正指標
    • 表現量穩定的基因
      • 有些基因的表現量在組織很穩定,不會受外來影響而有變化
      • 作為參考校正指標,也可監測PCR的效率
      • 如: housekeeping gene 在定量的組織裡有一定的表現量,不會因為外在的刺激而有量的變化
    • Internal dye reference
      • 機型內建參考螢光修正指標, ( A passive dye reference ROX) ,當成背景螢光,也就是在做PCR時產物的螢光要大於背景螢光,這時產物的螢光強度才會被偵測出來,超過了背景螢光,可以被偵測出來時就稱為 Ct,ABI使用ROX方式,也可以校正每次取量的誤差( pipetting error)
slide50
相對定量relative quanlity
    • 以內標來標準化所加入的待測樣本
    • 內標儘量選擇做PCR的效率與待測樣本接近的housekeeping gene 如: 18S Rrna、GAPDH、beta-actin
    • 分析基因表現量差異
    • 相對定量的標準化 ~Ct :是一個常數( constant value)
      • 如果PCR的效率在二個系統中是相等,系統中的A基因與B基因Ct值的差,在二個系統是一樣的
slide56
DNA甲基化的偵測方法
    • Epigenetics表異遺傳
      • DNA的序列上是相同的,但表型不同
      • 與染色質的結構有關
        • 染色體:雙鏈DNA,組織蛋白及少量 RNA構成的染色質( chromatin)折疊濃縮,加上非組織蛋白的骨架
        • 組織蛋白的DNA序列在物種間高度保留
        • 基因要表達必需使該基因所在的染色質區的結構有鬆動才能打開基因進行轉錄
        • 染色質是一種動態結構,適應環境及生理的需要做有次序的局部改變,讓DNA中不同的基因,隨生理需要而表達
slide57
改變染色質區域結構的因素
    • DNA甲基化:胞嘧啶環的第5個碳加上一個甲基m5C
    • 主要發生在CpG二核苷酸上的胞嘧啶,CG,3端的C最易甲基化
    • 藉由胞嘧啶5甲基轉移酶形成甲基化
      • 此酶表現量會影響基因表現,影響發育
    • 可能是演化的軌跡
      • 對抗外來DNA及病毒的防禦機制,類似限制酶
        • 跳躍子家族transposon family的高度甲基化
      • 基因的調節:不需表現的關閉
        • 甲基化數量也會影響基因的表現
    • DNA甲基化作用可引起染色質結構、DNA構型、DNA穩定性以及DNA與蛋白因子相互作用方式的改變,而控制基因的表達
    • 當DNA處於高甲基化狀態峙,基因表達受到抑制;當DNA處於低甲基化狀態時,基因就活化
slide59
細胞發育和分化過程中, DNA甲基化的作用,在於使特定基因有次序地表達
  • 甲基化DNA在基因組中的特異性分佈構成DNA甲基化圖譜
  • DNA甲基化、加強子、轉錄因于,和某些蛋白因子都能改變染色質的結構狀態,出現DNase I敏感區,使轉錄的DNA區域裸露,持續表現的持家基因或組織特異性表達的基因的promotor區及其旁側序列都對DNase I很敏感,稱為DNase I高敏感位置( DNase I highly sensitive site, DHSS) ,這是有利於基因表達的染色質結構
  • 特異化的組織有特徵性的甲基化圖譜:不同的細胞型態各自特 有甲基化圖譜稱為maintenance methylation
    • 此圖譜是由DnmtI甲基轉移酶所執行,也維持親代遺傳給子代的印痕(imprinting)圖
slide60
Histone modification組織蛋白修飾
    • 當基因在轉錄時,染色質是伸展的,組織蛋白被乙醯化
      • 組織蛋白N端的lysine被乙醯化(加上CH3CO- )與DNA的親和力降低,露出基因轉錄的單位,使參與轉錄的蛋白因子易進入
    • 乙醯化是一種可逆反應
      • Histone acetyltransferase, HAT
      • Histone deacetylase, HDAC
    • 被活化的轉錄因子進入細胞核上染色體上特定位置,可能乙醯轉移酶來到轉錄區,引起組織蛋白乙醯化,而使DNA裸露,這個裸露的DNA區域,使參與轉錄的蛋白因子進入而催化轉錄作用
    • 某些的轉錄因子會與DNA上的靜默子結合而幕集去乙醯轉移酶,而導致轉錄的停止
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DNA的甲基化會長期抑制DNA的轉錄
    • 組織蛋白乙醯化後造成DNA伸展,基因轉錄進行,
    • 基因CpG島上的 C也成為DNA甲基轉錄酶的目標
      • 甲基化的CpG雙核苷酸,會與特定的蛋白 MeCp2結合, MeCp2作用像一個轉錄抑制于( repressor)
      • repressor會幕集更多的蛋白因子(包括Sin3, Histone deacetylase)形成複合體,而這個MeCp2 也會與histone methyltransferase結合,而在histone 3上第9個lysine被乙醯化的殘基,接著會被甲基化,而這個甲基化的H3k9是染色質異質化蛋白(HPI)的 結合位點,這種結構會造成染色質濃縮,使得轉錄停止( Fuks et aI., 2003)
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檢測DNA甲基化的方法
    • 正常的細胞CpG雙核苷酸存在轉錄單位的promoter區域上,在轉錄時是非甲基化
    • 甲基化圖譜的改變是造成某些疾病或老化的原因
      • 腫瘤細胞常發現重要的tumor suppressor gene、DNA repair gene和轉錄抑制基因上的promoter 區域CpG高度甲基化
      • 老化的細胞中缺失性甲基化,使 5mC量下降
    • 利用methylation sensitive restriction enzyme來切,然後跑電泳做Southern blotting分析
      • 缺點是需大量的高品質DNA,雜合的( heterogeneous)甲基化情況下,分不出來
      • 使用DHPLC的方式來分析甲基化圖譜,也可以先用methylation-sensitive restriction enzyme來切,接著再做PCR
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Bisulfite-PCR-SSCP (BiPS)
    • Maelkawa et al. 2001 用sodium bisulfite來修飾CpG上的C
      • 將胞嘧啶環上的第4個碳去氨基,變成尿嘧啶(U)
      • U當模板做PCR時是被讀成T,甲基化的胞嘧啶環會抵抗 sodium bisulfite的作用,仍然是C
    • 引子要設計在CG island外面,然後跑PCR,將產物跑SSCP分析
    • 設計引子時要找promotor上CG island數目比較多 的區域,因CG甲基化數目也會影響基因調節
    • 這種方法不必使用限制酶,可做定量分析
    • 也可設計Multiplex primer將很多的CpG位點都擴增下來分析
    • 缺點
      • 如果CpG的位點都是甲基化時,可能只出現一條band
      • 甲基化是雜合性的或是任意的,跑出來的條帶會很複雜, 甚至整個條帶區模糊掉(smeared)
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Methylation-specific PCR (MSP)
    • 將模板用bisulfite來處理
    • 再設計一對unmethylated primer (U)及一對methylated primer (M)
    • 沒甲基化的引子(C→T),只會跟沒有甲基化的模板粘上,這樣區分甲基化與無甲基化
    • Methylation specific PCR更具特異性
      • 設計了特異性的引子(U及M)
      • 沒有限制酶切不乾淨的問題( false-positive)
      • 也要設計一對引子來擴增沒有經過bisulfite處理的模板,做為 對照組,來監測bisulfite修飾的效率
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DNA甲基化參與了基因表達的調節,在各個生命階段都有不同的甲基化圖譜 DNA甲基化參與了基因表達的調節,在各個生命階段都有不同的甲基化圖譜
    • 發育、染色質的結構、老化及癌症的發生,甲基化都參與這些複雜的過程
  • 老化的過程當中有整個基因組大範圍降低甲基化,而伴隨著一些特定位點的重新甲基化
    • DNMT1 DNA甲基轉移酶降低
    • Dnmt 3a, 3b老化中大量上升
  • 腫瘤抑制基因如VHL, hMLHl和p16 起動區上CpG的 高度甲基化與前列腺癌、乳癌、腎癌相關
  • DNA修補基因MGMT的甲基化 使基因不活化,也在腦、大腸、肺癌及淋巴瘤
  • 轉移抑制因于 DAP-Kinase基因,在淋巴瘤、白血病及肺癌中也被甲基化
  • 不同基因被甲基化是癌化的惡性表徵(惡性化的癌有很亂的甲基化圖譜,如loss of imprinting, LOI) ,而一些基因的甲基化是癌化的早期過程