Introduction to Optical Microscopy

1. Introduction to Optical Microscopy The Speaker: Leiting Pan The Tutor: Jingjun Xu

2. 内容 • 一.背景简介 • 二.显微镜相关参数 • 三.显微镜一些成像原理 • 四.荧光显微镜 • 五.激光扫描共聚焦显微镜（LSCM)

3. 一.背景简介 1.1显微镜发展史 • 1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器。 • 1610年前后，意大利的伽利略和德国的开普勒在研究望远镜的同时，改变物镜和目镜之间的距离，得出合理的显微镜光路结构。 • 1673～1677年期间，列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜。 • 19世纪，高质量消色差浸液物镜的出现，使显微镜观察微细结构的能力大为提高。 • 19世纪70年代，德国人阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础。 • 1850年出现了偏光显微术；1893年出现了干涉显微术；1935年荷兰物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术，他为此在1953年获得了诺贝尔物理学奖。 • 19世纪20年代，恩斯特·鲁斯卡用电子代替光制作了一个显微镜，能够把实物放大17倍，他获得了1986年诺贝尔奖的物理奖，现在可得到百万倍的放大，

4. 倒（正置）置显微镜 体视显微镜 金相显微镜 偏光显微镜 相差显微镜 干涉显微镜 微分干涉对比显微镜（DIC) 倒置（正置）荧光显微镜 数码显微镜 扫描隧道显微镜（STM） 扫描电子显微镜（SEM）（反射） 透射电子显微镜（TEM） 发射式电子显微镜 一.背景简介 1.2显微镜类别 光学显微镜 电子显微镜

5. 一.背景简介 1.2显微镜类别 Fig.1 正置显微镜 Fig.2 倒置显微镜 Fig.3 体视显微镜

6. 观察者 二.显微镜相关参数 2.1 显微镜光学原理 原理：主要由物镜和目镜组成，物镜的焦距很短，目镜焦距长，物镜作用是得到物体放大的实象，目镜是将物镜所成实象作为物体得到放大的虚象。 物体 到物镜L1距离稍大于物镜焦距F1, 通过物镜得到放大的实象 ， 位于目镜的焦距F2以内，是目镜的物体，通过目镜得到放大虚象 。 Fig.4 显微镜光路示意图

7. 二.显微镜相关参数 2.1显微镜分辨能力 Fig.5 改变数值孔径示意图 普通光线的波长为400~700nm，因此显微镜分辨力数值0.2μm左右，人眼的在明视距离分辨力是0.2mm，所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常为1000X。 提高分辨能力方法：使用低波长光源，增大介质n值，增大孔径角，提高对比度。

8. 二.显微镜相关参数 2.2显微镜放大率 显微镜总的放大率是物镜放大率和目镜放大率的乘积。显微镜放大是指被观察物的一维尺度放大。 当选用的物镜数值孔径不够大，即分辨率不够高时，显微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放大倍率，得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像，称为无效放大倍率。反之如果分辨率已满足要求而放大倍率不足，则显微镜虽已具备分辨的能力，但因图像太小而仍然不能被人眼清晰视见。所以为了充分发挥显微镜的分辨能力，应使数值孔径与显微镜总放大倍率合理匹配。

9. 二.显微镜相关参数 2.3显微镜焦深 • 焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。 • 焦深与物镜的数值孔径及分辨率成反比，物镜低倍到高倍切换再调焦，反之则不用。

10. 二.显微镜相关参数 2.4 显微镜参数视场数/视场直径 • 观察显微镜时，所看到的明亮的圆形范围叫视场 。 • 视场直径也称视场宽度，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。视场直径愈大，愈便于观察。 • F=FN/β，F-视场直径，FN-视场数（Field Number），β-物镜放大率。 • 蔡司视场数是23mm，用100X的物镜，其视场数是23mm/100＝0.23mm，就是说把一个0.23mm的线段放在显微镜下观察，线段两端正好在视野边缘。

11. 二.显微镜相关参数 2.5 显微镜参数工作距离/覆盖差 • 工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。镜检时，被检物体应处在物镜的一倍至二倍焦距之间。因此，它与焦距是两个概念，平时习惯所说的调焦，实际上是调节工作距离。 • 显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。由于盖玻片的厚度不标准，光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变，从而产生了相差，这就是覆盖差。覆盖差的产生影响了显微镜的成响质量。 • 数值孔径越大的物镜，工具距离越短，对盖玻片厚度有一定的要求。国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17mm，许可范围在0.16-0.18mm，在物镜的制造上已将此厚度范围的相差计算在内。物镜外壳上标的0.17，即表明该物镜所要求的盖玻片的厚度。

12. 二.显微镜相关参数 2.6显微镜物镜 • 1.消色差物镜（Achromatic objective）：校正了轴 上红，蓝二色点的位置色差、黄绿光球差。 • 2.复消色差物镜（Apochromatic objective）：校正 红、绿、蓝三色光的色差，校正红、蓝两色光的球差。 • 3.半复消色差物镜（Semi apochromatic objective）校正红、蓝两色光的球差和色差。 • 4.平视场物镜（Plan objective ）：视场平坦，校正场曲的缺陷，提高视场边缘成像质量的目的。 • 5. 单色物镜：紫外物镜 • 6. 特种物镜：相衬物镜，长工作距离物镜。

13. 二.显微镜相关参数 2.6显微镜物镜 • 1.色差（Chromatic aberration):光的波长不同 ，所以在通过透镜时的折射率也不同，这样物方一个点，在像方则可能形成一个色斑。光学系统最主要的功能就是消色差.单色光不产生色差。 • 2.球差(Spherical aberration)：球差是轴上点的单色相差，是由于透镜的球形表面造成的。球差造成的结果是，一个点成像后，不再是个亮点，而是一个中间亮边缘逐渐模糊的亮斑，从而影响成像质量。 • 3.慧差(Coma)：慧差属轴外点的单色像差。轴外物点以大孔径光束成像时，发出的光束通过透镜后，不再相交一点，则光点的像便会得到如豆点状，型如慧星，故称“慧差”。 • 4.像散（Astigmatism）：像散也是影响清晰度的轴外点单色像差。当视场很大时，边缘上的物点离光轴远，光束倾斜大，经透镜后则引起像散。象散使原来的物点在成象后变成两个分离并且相互垂直的短线。 • 5.场曲（Curvature of field）：场曲又称“像场弯曲”。当透镜存在场曲时，整个光束的交点不与理想像点重合，虽然在每个特定点都能得到清晰的像点，但整个像平面则是一个曲面。 • 6.畸变（Distortion）除场曲外，都影响象的清晰度。畸变是另一种性质的相差，光束的同心性不受到破坏。因此，不影响象的清晰度，但使象与原物体比，在形状上造成失真。

14. 三.显微镜一些成像原理 3.1 阿贝成象 • 阿贝成像原理: 物是一系列不同空间频率的集合.入射光经物平面发生夫琅和费衍射,在透镜焦面(频谱面)上形成一系列衍射光斑,各衍射光斑发出的球面次波在相面上相干叠加,形成像。 • 阿贝成像原理将成像过程分为两步:第一步“分频”;第二步“合成”。 • 由阿贝的观点来看：许多成像光学仪器就是一个低通滤波器,物平面包含从低频到高频的信息,透镜口径限制了高频信息通过,只许一定的低频通过,因此,丢失了高频信息的光束再合成,图象的细节变模糊. 孔径越大,丢失的信息越少,图象越清晰. • 意义：用频谱语言来描述信息,它启发人们用改造频谱的方法来改造信息。

15. 三.显微镜一些成像原理 3.1 阿贝成象 Fig.32 阿贝成象原理示意图 Fig.6 三种空间滤波器

16. 三.显微镜一些成像原理 3.2 相差成象 • 人的眼睛能够识别明与暗之差（光的强度）和颜色不同（光的波长不同），但难以识别差别小的无色的透明物体。 • 光对无色透明物体（相位物体）并不引起明、暗和颜色的变化，而只产生所谓的相位差。可是这种相位差不能用肉眼识别，也就看不见这种相位物体了。 • 相差显微镜利用阿贝成像原理，把相位信息转化为振幅信息，是观察透明物体的关键。

17. 三.显微镜一些成像原理 3.2 相差成象 环形光阑（实物图）：不同的环状孔形成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。由于透明圆环所成的像恰好落在物镜后焦点平面和相板上的共轭面重合。因此，未发生偏斜的直射光便通过共轭面。其作用是将直射光所形成的像从一些衍射旁像中分出来 。 相位板（观察图）：安装在物镜的后焦面处，相板装有吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜。它除能推迟直射光线或衍射光的相位以外，还有吸收光使亮度发生变化的作用。

18. 三.显微镜一些成像原理 3.2 相差成象 必需调节光阑的亮环和相板的环状圈重合对齐，才能发挥相差显微镜的效能。否则直射光或衍射光的光路紊乱，应被吸收的光不能吸收，该推迟相位的光波不能推迟，就失去了相差显微镜的作用。 Fig.7 相差显微镜原理示意图

19. 三.显微镜一些成像原理 3.2 相差成象 • 切片不能太厚，一般以5-10μm为宜。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ（波长），如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。 • A+相板：将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。 • B+相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。 Fig.8 1953年诺贝尔物理学奖得主荷兰人泽尔尼克

20. 三.显微镜一些成像原理 3.3 微分干涉差成像（DIC） • 组成：有四个特殊的光学组件-偏振器（polarizer）、DIC棱镜、DIC滑行器和检偏器（analyzer）。 • 原理：微分干涉相衬差成像是利用特制的渥拉斯顿棱镜来分解光束。分裂出来的光束的振动方向相互垂直且强度相等，光束分别在距离很近的两点上通过被检物体，由于标本的厚度和折射率不同，引起了两束光发生了光程差，在相位上略有差别。调节DIC滑行器的纵行微调来改变光程差，光程差可改变影像的亮度。检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光，从而使二者发生干涉，使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象。由于两光束的裂距极小（小于显微镜分辨率），而不出现重影现像，使图像呈现出立体的三维感觉。

21. 三.显微镜一些成像原理 3.3 微分干涉差成像（DIC） • 相差显微镜用于观察无色透明活细胞形态，分辨细胞轮廓及其结构结构。最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。 • DIC可以使被检物体产生三维立体感觉，观察效果更直观，无须特殊物镜，与荧光观察配合更好，适合观察一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作。 Fig.9 DIC原理光路示意图

22. 三.显微镜一些成像原理 3.3 微分干涉相差成像（DIC） Fig.10 普通明场滑膜细胞拍摄效果图 Fig.11 滑膜细胞的相差拍摄效果图 Fig.12 滑膜细胞相DIC拍摄效果图

23. 三.显微镜一些成像原理 3.4 偏光显微镜 • 将普通光改变为偏振光进行镜检,以鉴别某一物质具有单折射性(各向同性)或双折射性(各向异性)。 • 在生物样品中，肌肉纤维、骨骼和牙齿等具有各向异性，淀粉粒、染色体和纺锤体等具有双折射性，因此被用于组织细胞的化学研究。 Fig.13 偏光显微镜光学原理

24. 四.荧光显微镜 4.1.荧光显微镜原理 • 荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。 • 荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光作为激发光，激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分分析等的研究。

25. 四.荧光显微镜 4.2 荧光显微镜种类 Fig.14 透射式荧光显微镜 Fig.15 落射式荧光显微镜

26. 四.荧光显微镜 4.2.1透射式荧光显微镜 Fig.16 透射式荧光显微镜光路原理图 目镜 吸收滤色镜 物镜 暗场聚光镜 汞灯 激发滤色镜

27. 四.荧光显微镜 4.2.2 落射式荧光显微镜 Fig.17 落射式荧光显微镜光路原理图 汞 灯 吸收滤色镜 分色镜 物 镜 激发滤色镜 标 本

28. 四.荧光显微镜 4.3 激发光源及滤色块 • 高压汞灯拥有313, 337, 365, 405, 436, 546, and 577纳米的峰值谱。高压Xenon灯有连续的可见光光谱范围, 光源强度比较平均。 • 具有多套激发滤色块：激发滤色镜（Excitation Filter），分光镜（Dichromatic Mirror），发射滤色镜（Emission Filter）。 Fig.19 激发滤色块 Fig.18 汞灯光谱

29. 四.荧光显微镜 4.4 Zeiss落射式荧光显微镜 Fig.20 Zeiss落射式荧光显微镜实物光路图

30. 四.荧光显微镜 4. 4 荧光显微镜用途 • 观察标本中的自发荧光物质或以荧光素染色或标记的细胞和结构。 • 组织中的自发性荧光物质如神经细胞和心肌细胞等内的脂褐素呈棕黄色荧光，肝贮脂细胞和视网膜色素上皮细胞内的维生素A呈绿色荧光，某些神经内分泌细胞和神经纤维内的单胺类物质（儿茶酚胺、5－羟色胺、组胺等）在甲醛作用下呈不同颜色的荧光，组织内含有的奎宁、四环素等药物也呈现一定的荧光。嗜中性粒细胞中脱氢酶辅酶呈现一定的荧光。

31. 五.激光扫描共聚焦显微镜（LCSM） 5.1 共聚焦原理 Confocal 利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像 。 Fig.21 共聚焦光路原理图

32. 五.激光扫描共聚焦显微镜（LCSM） 5.1 共聚焦原理 Fig.22 共聚焦实际光路模拟图

33. 五.激光扫描共聚焦显微镜（LCSM） 5.2 共聚焦显微镜设计特点 • 1.点照明，激光照明系统。 • 2.具有照明pinhole和探测pinhole。 • 3.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦)，共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面。 • 4.具有扫描系统——逐点扫描成像 • 5.具有多个（四个） 荧光通道，可同时探测多个被标记物

34. 五.激光扫描共聚焦显微镜（LCSM） 5.3 共聚焦显微镜与传统显微镜区别 1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像。 2.具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片。 Z轴最小移动步距50nm（机械精度），Z轴成像分辨率0.35 m Conventional Confocal

35. 五.激光扫描共聚焦显微镜（LCSM） 5.3 共聚焦显微镜与传统显微镜区别 3. 由于点对点扫描去除了杂散光的影响 4. 增加侧向分辨率 人眼分辨率：0.2mm 光学显微镜分辨率：0.25um 共焦显微镜分辨率：0.18um 电子显微镜分辨率：0.2nm

36. slow 220lines/s 512*512 2-3秒 medium 450lines/s 512*512 1.7秒 fast 1000lines/s 512*512 0.7秒 128*128 0.2秒 五.激光扫描共聚焦显微镜（LCSM） 5.4 共聚焦显微镜技术参数 1.激光器光源：Ar激光器: 458nm, 476nm, 488nm, 514nm. GreNe : 543nm HeNe激光器: 633nm Ar激光器(UV): 361nm 2.扫描密度： 64*64，128*128，512*512，1024*1024，2048*2048 3. 扫描速度：

37. 五.激光扫描共聚焦显微镜（LCSM） 5.5 共聚焦显微镜应用 • 细胞内离子动态变化测量 • 线粒体膜电位的测量 • 荧光漂白恢复（FRAP）的测量 • 笼锁解笼锁的测量 • 荧光能量共振转移（FRET）的测量

38. 五.激光扫描共聚焦显微镜（LCSM） 5.6 荧光染色图 Fig.23 双重染色标本单色和双色观察

39. THE END THANK YOU!