TBC, "the reemergent killer "

1. TBC, "the reemergent killer" • aumento della tubercolosi nei paesi industrializzati • crescente diffusione dei ceppi di M. tuberculosis multiresistenti (MRMT)

2. la diagnostica tradizionale • esame microscopico • esame colturale • identificazione • antibiogramma

3. esame microscopico • colorazione di Ziehl-Neelsen • fluorescenza tecnica scarsamente sensibile e non specie-specifica

4. Ziehl-Neelsen 1000x

5. fluorescenza 400x

6. metodi colturali "alternativi" • metodo radiometrico • terreno bifasico • terreno con indicatore fluorescente • terreno Redox

7. il metodo radiometrico • flaconcini sigillati di terreno liquido contenente un substrato (ac. palmitico) marcato con 14C • miscela di antibiotici (PANTA) per il contenimento delle contaminazioni • liberazione di CO2 radiomarcata ad opera del metabolismo batterico • rilevamento di radioattività nella fase gassosa come spia di batteri metabolicamente attivi notevole accorciamento dei tempi di crescita maggior sensibilità

8. il terreno bifasico • flacone di terreno liquido per micobatteri • miscela di antibiotici (PANTA) per il contenimento delle contaminazioni • slide con vari tipi di terreni solidi (all'uovo, agarizzato, agar cioccolato) • arricchimento nel brodo e sviluppo di colonie isolate sul terreno solido moderato accorciamento dei tempi di crescita maggior sensibilità

9. medium con indicatore fluorescente • provetta di terreno liquido per micobatteri • miscela di antibiotici (PANTA) per il contenimento delle contaminazioni • fluorocromo, incorporato in un film di silicone sul fondo della provetta, sensibile alle variazioni del contenuto di ossigeno • comparsa di fluorescenza per effetto del consumo di ossigeno operato dal metabolismo batterico • rilevamento della fluorescenza • visivo, sotto una lampada UV • automatizzato accorciamento dei tempi di crescita maggior sensibilità

10. il terreno Redox • i micobatteri crescono nel terreno liquido di Kirchner formando piccoli fiocchi o intorbidamento uniforme • i sali di tetrazolio presenti nel terreno vengono ridotti a formazzano dai micobatteri in crescita • il formazzano, rosa-violetto ed insolubile, si fissa alla superficie delle colonie micobatteriche permettendone il riconoscimento

11. automazione nella coltura dei micobatteri • metodo radiometrico • la produzione di CO2 radiomarcata viene rilevata da un -counter • metodo pressometrico • l’aumento di pressione, dovuto a produzione di CO2, viene rilevato da un manometro • metodo fluorimetrico • la fluorescenza di un indicatore, inibita dalla presenza di ossigeno nel terreno, viene ripristinata per effetto del consumo di ossigeno • metodo refrattometrico • la produzione di CO2 fa virare un sensore che a sua volta modifica l’intensità di un raggio di luce riflessa

12. l’emocoltura per micobatteri 1 • la ricerca dei micobatteri nel sangue è giustificata per i pazienti immunodepressi nei quali può essere richiesta anche la mielocoltura • la bassa sensibilità rende inutile l’esecuzione dell’esame microscopico • un tipo particolare di emocoltura è quello che si esegue sul sangue mestruale quando si sospettano forme tubercolari a carico dell’apparato genitale

13. l’emocoltura per micobatteri 2 • semina diretta del sangue • nei flaconi Bactec 13A • nei flaconi BacT ALERT MB blood • nelle bottiglie Bactec MYCO/F Lytic • semina dopo lisi-centrifugazione (sistema Isolator) • su tutti i terreni solidi (a base di uovo o sintetici) • in tutti i terreni liquidi compresi quelli, non dedicati alle emocolture, impiegati dai sistemi automatizzati • nel terreno bifasico

14. l’emocoltura per micobatteri 3 • la sensibilità dei terreni solidi è notevolmente inferiore a quella dei terreni liquidi • tempi di incubazione inferiori alle otto settimane sono sconsigliati anche per i terreni liquidi • le specie appartenenti al MAC sono di gran lunga quelle di più frequente reperimento • lo sviluppo di micobatteri in terreno liquido che non crescono nelle subcolture su terreno solido deve far pensare alla presenza della specie M. genavense

15. identificazione tradizionale, test biochimici • accumulo di niacina • riduzione dei nitrati • catalasi • quantitativa • termoresistente • idrolisi del Tween 80 • ureasi • arilsolfatasi • riduzione del tellurito

16. identificazione tradizionale, test colturali • velocità di crescita • aspetto delle colonie • rugose lisce • fotocromogene • scotocromogene • non pigmentate • crescita a varie temperature • test di inibizione selettiva

17. NAP test • il p-nitro-acetil-amino-idrossi-propriofenone (NAP), aggiunto al terreno di coltura, inibisce lo sviluppo dei micobatteri appartenenti al M. tuberculosis complex ma non quello dei micobatteri non tubercolari • risultati accettabili solo in terreno liquido test di screening rapido (4-7 gg)

18. metodi di identificazione “alternativi” • DNA probe • HPLC degli acidi micolici • sequenziamento genico • 16S rDNA • SOD • HSP65

19. il sistema AccuProbe • lisi delle cellule batteriche e liberazione del rRNA • probe marcato costituito da un frammento di DNA a filamento singolo contenente una sequenza specie-specifica presente in una regione ipervariabile del rRNA • ibridizzazione in presenza di complementarità fra rRNA e probe • rimozione della marcatura dal DNA non ibridizzato • eccitazione della molecola marcatrice chemioluminescente • rilevamento della luce prodotta in presenza di molecole ibride di acidi nucleici metodo rapido (2 h) altamente specifico

20. HPA (hybridization protection assay) • gli esteri di acridinio utilizzati come marcatori emettono luce se eccitati chimicamente • nel DNA a catena singola la molecola marcatrice è esposta all'azione di eventuali agenti inattivanti • la struttura assunta dall'acido nucleico a catena doppia protegge la molecola marcatrice dall'azione di eventuali agenti inattivanti • l'aggiunta di agenti inattivanti elimina ogni possibilità di emissione di segnale da parte di molecole non ibridizzate, l'emissione di luce è pertanto indice di avvenuta ibridizzazione

21. Line Probe Assay (LiPA)

22. LiPA, interpretazione

23. gli acidi micolici • acidi grassi, ramificati in posizione  • presenti nella parete batterica dei generi: • Corynebacterium: 22-38 atomi di C • Rhodococcus: 34-52 atomi di C • Nocardia: 44-60 atomi di C • Gordona: 48-66 atomi di C • Tsukamurella: 64-78 atomi di C • Mycobacterium: 60-90 atomi di C • presenza di numerosi gruppi funzionali che differenziano 7 tipi di acidi micolici micobatterici • alfa-, alfa'-, metossi-, keto-, epossi-, cere, omega' metossi-

24. HPLC degli acidi micolici • saponificazione, estrazione e derivatizzazione degli acidi micolici presenti nella parete dei micobatteri • frazionamento mediante HPLC • individuazione dei picchi presenti nel tracciato cromatografico e identificazione per confronto con profili di riferimento

25. profilo HPLC del M. tuberculosis complex • ad eccezione del M. bovis BCG SI

26. SI SI esempi di profili HPLC

27. TLC degli acidi micolici

28. gas-cromatografia

29. RNA ribosomiale 16S

30. antibiogramma • i farmaci antitubercolari maggiori • il principio del metodo delle proporzioni • l’antibiogramma manuale • l’antibiogramma automatizzato • l’antibiogramma sui micobatteri non tubercolari

31. antibiogramma radiometrico • inoculo di una serie di flaconcini radiometrici, addizionati con antibiotici, con una sospensione micobatterica standardizzata • inoculo di un flaconcino di controllo con una diluizione 1/100 della sospensione precedente • lettura radiometrica giornaliera fino al raggiungimento, da parte del controllo, di una soglia prefissata • sensibilità flaconcini con incremento giornaliero inferiore a quello del controllo • resistenza flaconcini con incremento giornaliero superiore a quello del controllo metodica di riferimento, durata 5-10 gg

32. le fasi dellaPolymerase Chain Reaction • pretrattamento del materiale e liberazione dell'acido nucleico • fluidificazione ed eventuale decontaminazione • lavaggio • lisi delle cellule • amplificazione dell'acido nucleico • rilevamento dell'amplificato

33. componenti principali dellamiscela di amplificazione NUCLEOTIDI PRIMER: oligonucleotidi complementari di sequenze presenti alle due estremità della regione da amplificare POLIMERASI: enzima che determina l'allungamento dei primer utilizzando i nucleotidi presenti nella miscela di reazione

34. i componenti della Mastermix del sistema AmplicorM. tuberculosis • NUCLEOTIDI • assenza di nucleotidi contenenti timina (sostituiti da quelli contenenti uracile) • PRIMER • complementari di sequenze che delimitano una regione del genoma specifica del genere Mycobacterium • marcati con biotina • POLIMERASI • Taq polimerasi

35. il sistema AmpErase per la prevenzione delle contaminazioni • il DNA-target non contiene uracile • il DNA-amplificato contiene uracile al posto della timina • l'aggiunta di uracil-N-glicosilasi al materiale da amplificare determina la distruzione di qualsiasi traccia di DNA contaminante (frutto di precedenti amplificazioni); l'enzima è invece del tutto inattivo sul DNA-target

36. i cicli termici della reazione di amplificazione • 20 sec a 94°C: la doppia elica del DNA si separa ed i filamenti singoli costituiscono lo stampo per successive amplificazioni • 20 sec a 62°C: i primer si legano alle sequenze complementari presenti sul DNA-target (annealing) • 45 sec a 72°C: la polimerasi determina l'allungamento dei primer utilizzando i nucleotidi presenti nella miscela di reazione 30 cicli (ne sono previsti 35) determinano la formazione di un miliardo di copie del DNA originale

37. il rilevamento dell'amplificato • trasferimento dell'amplificato in un pozzetto di una piastra microtiter, coated con probe complementari di una sequenza dell'amplicone specifica per il M. tuberculosis • incubazione (ibridizzazione) • lavaggi (eliminazione dell'amplificato non ibridizzato) • aggiunta del coniugato avidina-enzima • incubazione (legame avidina-amplicone biotinilato) • lavaggi (eliminazione del coniugato non legato) • aggiunta del substrato • incubazione (reazione enzimatica) • bloccaggio della reazione enzimatica • lettura fotometrica a 450 nm

38. le fasi della Transcriptase Mediated Amplification • fluidificazione e decontaminazione del campione • lisi (ultrasuoni) delle cellule • trasferimento del lisato in provette contenenti la miscela di amplificazione e breve incubazione a 95°C • aggiunta della miscela enzimatica e amplificazione isotermica (2 h a 42°C) di una regione del rRNA specifica del genere Mycobacterium • blocco dell'amplificazione ed ibridizzazione dell'eventuale amplificato con un DNA-probe specifico per il M. tuberculosis complex • rilevamento HPA dell'eventuale ibridizzazione

39. il principio della TMA • annealing dei primer, presenti nella miscela di reazione, con il rRNA liberato mediante lisi cellulare • sintesi di DNA a partire da RNA grazie alla transcriptasi inversa • separazione dell'ibrido DNA-RNA ad opera della RNasi • utilizzo del DNA come stampo per la sintesi di molte copie di RNA ad opera della polimerasi • ulteriore annealing del RNA sintetizzato con nuovi primer non occorrono cicli termici perché manca la fase di denaturazione formazione di 10 miliardi di copie in 2 ore

40. sito di restrizione bamper primer 5’ 3’ target la Strand Displacement Amplification • TARGET: IS6110 • PRINCIPALI COMPONENTI DELLA MISCELA DI AMPLIFICAZIONE: • bamper • primer • polimerasi • enzima di restrizione non occorrono cicli termici perché manca la fase di denaturazione

41. SDA: amplificazione esponenziale

42. il rilevamento dell’amplificato nella SDA

43. il rilevamento dell’amplificato nella SDA

44. il rilevamento dell’amplificato nella SDA

45. il rilevamento dell’amplificato nella SDA

46. il rilevamento dell’amplificato nella SDA

47. il rilevamento dell’amplificato nella SDA

48. il rilevamento dell’amplificato nella SDA

49. il rilevamento dell’amplificato nella SDA

50. il rilevamento dell’amplificato nella SDA