1 / 18

בדיקת פיזור רצפי RNAi בגנום של c-elegans

בדיקת פיזור רצפי RNAi בגנום של c-elegans. אודי חוזה. יאיר ארנפרוינד. מנחה: ד"ר רון אונגר. RNAi. תופעה שבה שרשראות קטנות של RNA הנקראות siRNA (small interfering RNA) מדכאות התבטאות של חלבון מסוים ע"י דגרדציה של mRNA מתאים. siRNA. גילוי ה RNAi.

penney
Download Presentation

בדיקת פיזור רצפי RNAi בגנום של c-elegans

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. בדיקת פיזור רצפי RNAi בגנום של c-elegans אודי חוזה יאיר ארנפרוינד מנחה: ד"ר רון אונגר

  2. RNAi תופעה שבה שרשראות קטנות של RNA הנקראות siRNA (small interfering RNA) מדכאות התבטאות של חלבון מסוים ע"י דגרדציה של mRNA מתאים siRNA

  3. גילוי ה RNAi לפני יותר מעשור, התגלה ע"י החוקר Rich Jorgensen, שכאשר מנסים להזריק לפטוניות גן לפיגמנט שיוצר צבע סגול תחת פרומוטור חזק, על מנת להגביר את הצבע הסגול, מתקבל במקום צבע סגול חזק, צבעים מגוונים ואפילו צבע לבן.  ע"י כך הסיקו שהחדרת הגן לפיגמנט סגול שהומולוגי לגן המקורי גורם לחוסר ביטוי של הגן המוזרק + להשתקה של הגן המקורי.

  4. גילוי ה RNAi 1998: פריצת הדרך. התגלה ע"י החוקרים FIRE &MELLO שהזרקת dsRNAגורמת ג"כ לסופרסיה בביטוי גנים שמכילים רצפים הומולוגים לאותם dsRNA. הסופרסיה הזו יעילה בהרבה מסופרסיה שנעשית ע"י strand בודד. המנגנון כונה RNAi

  5. Dicer GGAUGAUUGAGUAGCAGGCA ACGUAGAUGAUUGAGUAGC UGC ACG RISC mRNA UGC 20-25nt ACG מכניזם הפעולה של RNAi Consists of Two RNA binding proteins and a nuclease nicknamed as Slicer RNA- stem-loop-stem Free to go AAAGUCUAGAGUCGAUGA UUUCAGAUCUCAGCUACU degradation CGACAAACGAUUUCAGAUCUCAGCUACUUCCGAACAGUGCAUGGCCCGAUA

  6. מאפייני ה RNAi • קיים רק באיאוקריוטים (בפרוקריוטיםיש RNaseIII שמפרק dsRNA). • ספציפיות לרצף מסויים בגנום שהומולוגי לו. • פוטנטי מאד (כדי לגרום ל interference דרושות רק מעט מול' של dsRNA בתא).

  7. מאפייני ה RNAi -המשך • יכול לגרום לאינאקטיבציה של גנים גם מחוץ לרקמה שבה הוא נמצא. • יכול לחצות קרומי תא. • יכול לעבור מדור לדור.

  8. מטרת מנגנון ההשתקה: • משמש להתגוננות של האורגניזם מפני זיהומים או וירוסים. • מונע פעילות של טרנספוזונים. • מנגנון ההשתקה פועל כאשר מוחדרים לתא טרנסגנים מסויימים, במעבדה. • מחקרים רבים מרמזים על כך שמרכיבים שונים במנגנון ההשתקה שפועל באמצעות RNAi מתפקדים ברגולציה על ביטוי גנים שונים בתאים של אורגניזמים.

  9. איך נחפש RNAi בגנום • מנגנון של RNAi , מורכב מהגן שאותו מבקשים להשתיק, ומ- dsRNA שבעזרתו נשתיק את הגן. • הבעיה: ע"מ למצוא RNAi בגנום, יש למצוא רצף מסוים ולוודא שיש לו רצף משלים בקרבתו ע"מ שיוכלו ליצור ביחד את מבנה ה hairpin . כיצד נעשה זאת?

  10. GGAUGAUUGAGUAGCAGGCA ACGUAGAUGAUUGAGUAGC ACG CCGAAAGUCUAGAGUC dsRNA במבנה hairpin איך נחפש RNAi בגנום • הרצף היוצר את ה hairpin הוא בעצם פלינדרום ביולוגי UGA…CGA GCACUGAGAUCUGAAAGCC UGC GGCUUUCAGAUCUCAG

  11. אותו המקום ב DNA איך נחפש RNAi בגנום • ניתן לראות שרצף ה antisense זהה בדיוק לרצף ה sense אך הפוך! • כלומר, אם נפתח את הדו-גדיל נקבל את אותו הרצף פעמיים !! antisense …GTCTAGAGTCGATGAACGACT….GCTCGTTCATCGACTCTAGAC… …CAGATCTCAGCTACTTGCTGA….CGAGCAAGTAGCTGAGATCTG… sense כעת אם נמצא הופעה נוספת של אחד הרצפים בגן ידוע-נוכל להגיד שמצאנו מועמד פוטנציאלי לשמש RNAi

  12. איך נחפש RNAi בגנום-סיכום • לאחר שנפתח את ה DNA נחפש 3 הופעות זהות של אותו הרצף. • לפחות אחד ההופעות חייב להיות בגן ידוע (target), והשניים האחרים צריכים להיות במרחק של 5-500bp אחד מהשני כך שיוכלו ליצור מבנה hairpin. • אין חשיבות למיקומם בגנום-הם יכולים להופיע גם במקומות חסרי חשיבותלכאורה, כגון אינטרונים או UTR.

  13. חיפוש בעזרת Suffix array סיבוכיות: • בניית ה suffix arrayבמיון quick sort: O(nlogn) • מיון אלפבתי של האינדקסים נעשה לפי אורך מחרוזת של 20bp . • אינדקסים של מחרוזות זהות בהכרח יופיעו אחד לידהשני

  14. חיפוש ב suffix array • לאחר בניית ה suffix array , נחלק את המערך לקבוצות של אינדקסים זהים. • ננסה להרחיב את אורך ההתאמות עד לגודל המקס' האפשרי, ע"מ שלא לאבד מידע ולמנוע כפילות מידע.

  15. סינון המידע בכל קבוצת אינדקסים זהים נחפש לפחות זוג אחד שיכול ליצור מבנה של stem-loop . כלומר שעבור אחד האינדקסים נמצא התאמה בצד הכרומוזום ההפוך, שתהיה במרחק 5-500bp . …GGCTTTGA….CGAAAGCC… …GGCTTTCG….TCAAAGCC… Sense Antisense קבוצה שאין בה זוג כזה, אינה רלוונטית עבורנו ותסונן!

  16. עיבוד המידע לאחר הסינון, נתייג כל רצף שמצאנו לפי מיקומו בגנום: אקסון/ אינטרון/5UTR /3UTR /intergenic לכאורה, היינו מצפים שכל ה Targets יהיו באקסונים, וה – stem-loops יהיו באיזורים שלא מקודדים לחלבון כמו אינטרונים או intergenic regions . אבל- ממקרים של RNAi שכבר נמצאו, מסתבר שה- Targetsדוקא נמצאים במקרים רבים ב- 3UTR !

  17. עיבוד המידע עיבוד המידע מתבצע בשתי גישות: • עבור כל Target – נבדוק אילו stems מתאימים לו. • עבור כל stem- נבדוק אילו Targetsמתאימים לו. כעת, בעזרת כלים סטטיסטים ננתח את התפלגות מיקומי ה Targetsוה stems בגנום של C.elegans

  18. The end תודה רבה ל: ד"ר רון אונגר יאיר חורש תרצה דוניגר

More Related