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FACS. Eine kurze Einführung in die Durchflußzytometrie C.Schütt. cs.ppt 2003. Bone marrow. Blood. Wie erhält man Informationen über die Funktionstüchtigkeit des Immunsystems ?. Bone marrow. cs22 origin of blood cells. pluripotent hematopoietic stem cell.

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Presentation Transcript
slide1

FACS

Eine kurze Einführung in die

Durchflußzytometrie

C.Schütt

cs.ppt 2003

cs22 origin of blood cells

Bone marrow

Blood

Wie erhält man Informationen über die

Funktionstüchtigkeit des Immunsystems ?

Bone marrow

cs22 origin of blood cells

pluripotent hematopoietic stem cell

megakaryocyte/

erythrocyte

progenitor

granulocyte/macrophage

progenitor

common

lymphoid progenitor

common myeloid

progenitor

megakaryocyte

erythroblast

Granulocytes (or polymorphonuclear leukocytes)

unknown

precursor

immature

dentritic cell

monocyte

platelets

erythrocyte

T cell

neutrophil

eosinophil

basophil

B cell

Effector cells

Tissues

Lymph nodes

immature

dendritic cell

mature

dendritic cell

activated

T cell

mast cell

macrophage

plasma cell

slide3

Die Expression von Rezeptoren oder Adhäsions-

molekülen charakterisiert einen Zelltyp oder einen

funktionellen Status

aber im Mikroskop sehen sie alle gleich aus...

doch mit markierten monoklonalen Antikörpern (mAb)

mit Spezifitäten gegen solche Oberflächenmoleküle

können wir diese Zellen im Fluoreszenzmikroskop

oder im Durchflußzytometer differenzieren

cs895f

slide4

Death

Die Expression von Rezeptoren oder Adhäsions-

molekülen charakterisiert einen Zelltyp oder einen

funktionellen Status

gStainin

CD3

CD69

activated

T

CD14

Mo

T

CD3

Es gibt z.Z. 247 verschiedene Oberflächenmoleküle,

die mit monoklonalen Antikörpern als

"Clusters of Differentiation" (CD)

identifizierbar sind.

cs895f

cs521 cd nomenclature

CD Nomenklatur

cs521 CD nomenclature

Official Poster of the 7th Int. Workshop on

Human Leukocyte Differentiation Antigens

CD1

als Beispiel

www.bdbiosciences.com/pharmingen/

CD247

slide6

Antikörper als Handwerkszeuge

gStainin

Zwei Fluoreszenzfarbstoff-markierte mAbs, hier z.B.

spezifisch für CD3 and CD14

"Oberflächenmarker" CD3

wird auf allen T Zellen exprimiert

T

unspezifische

Bindung

Spezifische Bindung des antiCD3mAb

macht die Identifizierung aller T Zellen möglich

cs895a

cs895

slide7

Ein typisches Durchflußzytometer

Detector &

Mechanical

Computer System

Fluidics

Die mit Antikörpern "angefärbten" Zellen

werden aus der Zellsuspension aufgesaugt

und jede einzelne in einem Hüllstrom

im Laserlicht analysiert...

10 000 Zellen in wenigen Minuten !

cs895e

slide8

Grösse und Granularität

Granulozyten

FSC

SSC (granularity)

Laser

Monozyten

FSC (cell size)

SSC

Lymphozyten

FSC- Vorwärtsstreuung; SSC- Seitwärtsstreuung

cs895a

slide9

cell number

log fluorescence intensity(red)

Identifizierung einer Zellpopulation

z.B. Anteil der B Tellen: CD19+

58% negativ

für Antigen A

FSC

42% positiv

für Antigen A

Laser

FL2

cs895b

cs895d facs
cs895d FACS

Charakterisierung einer Zellpopulation mittels

Zweifarbenfluoreszenz

A+(%)

z.B.aktivierte T Zellen: CD3+CD69+

ruhende T Zellen: CD3+CD69 -

A+ B+(%)

FSC

Log fluorescence (red)

Laser

Log fluorescence (green)

FL1

FL2

neg.

(%)

B+(%)

slide11

Mehr Informationen :

www.medizin.uni-greifswald.de/immun/lehrver/cytometry/cytometry.htm

cs 2003