Download
1 / 21
220 likes | 519 Views
Sterowanie metabolizmem. Sterowanie metabolizmem. Wydajna produkcja metabolitu Zakłócenie procesów metabolicznych Przejściowe Trwałe zmiana warunków modyfikacja środowiska genotypu.
E N D
Sterowanie metabolizmem Wydajna produkcja metabolitu Zakłócenie procesów metabolicznych Przejściowe Trwałe zmiana warunków modyfikacja środowiska genotypu
Sterowanie metabolizmem Zmiany warunków środowiskowych • Indukcja substratowa i represja kataboliczna • Represja produktami reakcji enzymatycznych • Zwiększenie przepuszczalności osłon komórkowych • Zmiana preferencji metabolicznych • Dodatek prekursorów • Regulacja źródłem węgla • Regulacja związkami azotu • Regulacja fosforanowa • Regulacja parametrami fizyko-chemicznymi • temperaturą • pH • natlenianiem
Sterowanie metabolizmem Modyfikacje genotypu • Zmiana aktywności enzymów • Mutanty auksotroficzne • Mutanty regulatorowe • Szczepy otrzymywane metodami inżynierii genetycznej
Indukcja substratowa i represja kataboliczna • Indukcja substratowa – umożliwia syntezę określonych enzymów wyłącznie w obecności odpowiedniego substratu lub jego strukturalnego analogu • Represja kataboliczna – obecność łatwo przyswajalnego substratu hamuje syntezę enzymów potrzebnych do przyswajania innych potencjalnych substratów Represja kataboliczna jest mechanizmem dominującym
Indukcja substratowa i represja kataboliczna Degradacja substratów wielkocząsteczkowych Przyswajanie związków małocząsteczkowych IPTG – izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozyd
Indukcja substratowa i represja kataboliczna • Brak represji katabolicznej nie wystarcza do syntezy białek, jeżeli nie ma induktora • Obecność induktora nie wystarcza do syntezy białek, jeżeli jest represja • Synteza białek zachodzi jedynie w obecności induktora i przy braku represji katabolicznej R – represor B1, B2, B3 – białka biorące udział w metabolizmie substratu A – struktura regionu regulatorowego
Indukcja substratowa i represja kataboliczna Mechanizm często wykorzystywany przy konstrukcji systemów ekspresyjnych E. coli
Przemysłowa produkcja aminokwasów Aminokwasy egzogenne • Fenyloalanina • Izoleucyna • Leucyna • Lizyna • Metionina • Treonina • Tryptofan • Walina • Asparagina • Histydyna Kwas glutaminowy ??? Ponad 50% rocznej produkcji aminokwasów Glutaminian sodu – wzmacniacz smaku Składnik przypraw i żywności w proszku
Produkcja kwasu glutaminowego Corynebacterium glutamicum • Gram + • Morfologicznie zmienne • krótkie pałeczki • maczugowce • ziarniaki • Tlenowe lub względnie beztlenowe • Optymalna temp. 28-30 °C • Wykazują auksotrofię biotynową
Produkcja kwasu glutaminowego Wydajna produkcja wymaga usuwania kwasu glutaminowego z komórki • Zwiększenie przepuszczalności osłon komórkowych • deficyt biotyny • nadmiar nasyconych kwasów tłuszczowych • detergenty • antybiotyki hamujące syntezę peptydoglikanu ściany komórkowej Zmiana warunków środowiskowych
Produkcja kwasu glutaminowego Wydajna produkcja wymaga usuwania kwasu glutaminowego z komórki • Zwiększenie przepuszczalności osłon komórkowych • auksotrofia glicerolowa • auksotrofia oleinowa Mutanty auksotroficzne
Produkcja lizynyCorynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum Zmiana preferencji metabolicznych - hamowanie jednego z odgałęzień szlaku metabolicznego przez nadmiar produktu tego odgałęzienia 1 – syntaza dihydropikolinianowa 2 – dehydrogenaza homoserynowa 3 – transacylaza homoserynowa 4 – dehydrataza homoserynowa
Produkcja lizynyCorynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum Mutanty auksotroficzne Hser- • Kinaza asparaginianowa (7) produkowana jest konstytutywnie • Podlega regulacji allosterycznej w obecności L-lizyny i L-treoniny (jednoczesny nadmiar obu aminokwasów) • Mutacja dehydrogenazy homoserynowej (8) znosi negatywną regulację kinazy asparaginianowej
Produkcja penicyliny Prekursory • L-cysteina • L-walina • Kwas L-α-aminoadypinowy Enzymy • syntetaza L-α-aminoadypinoilo-L-cysteinylo-D-waliny (syntetaza ACV) • syntaza izopenicyliny N (syntaza IPN) • Acylaza penicylinowa • Acylotransferaza izopenicyliny N
Regulacja źródłem węgla Produkcja penicyliny przez Penicillium chrysogenum • Wymaga zniesienia ogólnometabolicznego układu represji katabolicznej • Decyduje nie rodzaj źródła węgla, ale szybkość jego metabolizmu • Represja kataboliczna • synteza kwasu L-α-aminoadypinowego (L-α-AA) • synteza syntetazy L-α-aminoadypinoilo-L-cysteinylo-D-waliny (syntetazy ACV) • synteza syntazy izopenicyliny N (syntazy IPN)
Regulacja fosforanowa Produkcja penicyliny przez Penicillium chrysogenum • Wymaga zniesienia ogólnometabolicznego układu represji katabolicznej • Nadmiar jonu fosforanowego pogłębia efekt represji katabolicznej • stymuluje transport glukozy do komórki • stymuluje metabolizm glukozy
Regulacja związkami azotu Produkcja penicyliny przez Penicillium chrysogenum Wymaga obecności glutaminy jako donora grupy aminowej w syntezie aminokwasowych prekursorów penicyliny Nadmiar jonu amonowego powoduje represję syntetazy glutaminowej
Dodatek prekursorów Produkcja penicyliny G przez Penicillium chrysogenum • Selektywna produkcja penicyliny G wymaga dodatku prekursora reszty benzylowej • fenylooctanu • fenyloalaniny
Mutanty regulatorowe • mutageneza genów kodujących białka regulatorowe (represory) • mutageneza sekwencji operatorowych • mutageneza genów kodujących enzymy allosteryczne
