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Molecular simulation of proteins involved in neurodegenerative diseases:  the case of

Molecular simulation of proteins involved in neurodegenerative diseases:  the case of alpha- synuclein. Valeria Losasso German Research School for Simulation Sciences GmbH Jülich, Germany. Fatal neurodegenerative movement disorder, affecting an estimated four million people worldwide.

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Molecular simulation of proteins involved in neurodegenerative diseases:  the case of

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Presentation Transcript

  1. Molecular simulation of proteins involved in neurodegenerative diseases:  the case of alpha-synuclein Valeria Losasso German Research School for Simulation Sciences GmbHJülich, Germany

  2. Fatal neurodegenerative movement disorder, affecting an estimated four million people worldwide • Loss of the neuromelanine expressing dopamine (DOP) neurons in the substantia nigra pars compacta Parkinson’s disease (PD) • Diagnostic features: • Tremor • Rigidity • Akinesia and bradykinesia • Postural instability Polymeropoulos MK et al., Science, (1997)

  3. Deposition of Lewy bodies Parkinson’s disease (PD) Spillantini MG et al., Nature, 1997 • Major components: aggregates of alpha-synuclein (a-syn) protein N-terminal NAC C-terminal Cookson MR, Annu, Rev. Biochem., 2005

  4. Unstructured protein Partially folded intermediates Alpha synuclein Flexibility and changes in secondary structure are essential for the conformational rearrangements driving the formation of aggregated states Uversky VN et al., Annu. Rev. Biophys, 2008 Soto C. et al., Nat, Rev. Neurosci., 2003

  5. Overview Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogs • Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogs (Latawiec D. et al., PLoS ONE, 2010) • Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants

  6. PD pathogenesis x x Soto C. et al., Nat, Rev. Neurosci., 2003 Bisaglia M. et al., J. Biol. Chem., 2007

  7. Structural basis of the inhibition Molecular dynamics (MD) simulations based on α-syn’s nuclear magnetic resonance (NMR) structural ensemble: • nonspecific hydrophobic contacts between dopamine (DOP) and its oxidation derivatives with the C-terminal; (125YEMPS129 region) Conway KA. et al., Science., 2001 Norris EH et al., J. Biol. Chem., 2005 • long-range electrostatic interactions with residues in the NAC region which are involved in the fibrillization process (E83) Herrera FE. et al., Plos ONE., 2008

  8. Aim of the work Molecules structurally and electrostatically similar to a given ligand might provide similar structure/activity relationships Bostrom J et al., J. Med. Chem., 2006 Screening of ligands structurally and electrostatically similar to DOP Study of their binding to a-synuclein through MD simulations

  9. Methods • Initial protein structures NMR studies based on paramagnetic relaxation enhancement (PRE) Vendruscolo M., personal communication Dedmon MM et al., J. Am. Chem. Soc., 2005 • Cluster analysis • (Micheletti C. et al., Proteins, 2000) 6 representative structures • Ligand selection Ligand.info database (von Grotthuss et al., Comb. Chem. High Throughput Screen., 2004) 60 molecules selected (10 for DOP and each derivative) Shape and electrostatic similarity (Tanimoto T.. IBM Internal Report, 1957) 5 commercially available ligands

  10. Methods • Initial protein structures Docking 30 adducts with new ligands + 36 adducts with DOP and its oxidized products (Morris et al., J. Comp. Chem., 1998) 6 representative structures • Ligand selection

  11. Methods • Investigate structural stability by Molecular Dynamics (MD) • Standard MD setup: • NAMD code • Amber force field (parm99.dat) • Resp parametrization of ligands • Timestep 2 fs • TIP3P water model with PBC • NPT ensemble, 300 K (1 bar) • SHAKE algorithm • Particle Mesh Ewald (10 Å) • Atoms: ~ 50.000 • Experimental studies – in vitro fibrillization essays (G. Legname and S. Gustincich, SISSA/ISAS, Italy)

  12. Results – Molecular Dynamics (Kcal/mol) (Kcal/mol)

  13. Results – Molecular Dynamics (Kcal/mol) (Kcal/mol) Test in vitro Strongest effect on fibrillization?

  14. Results – In vitro fibrillization essay

  15. Results – AFM analysis of aggregation • mature fibrils >0.75 mm • intermediate fibrils 0.5-0.75 mm • short fibrils (or protofibrils) <0.5 mm No fibrils, only spherical structures 5-hydroxyindole 5-hydroxyindole 4-(2-aminoethyl)aniline 6-aminoindole 6-aminoindole a-syn only a-syn + DOP 2-amino-4-tertbutylphenol a-syn only tyramine

  16. Results – TEM analysis of aggregation a-syn alone: fibrils in cluster and longer than 0.75 mm 5-hydroxyindole: cluster of shorter fibrils 6-aminoindole: individual stuctures, early stage of fibrillization

  17. Conclusions 5 ligands identified with a weaker predicted inhibitory effect on fibrillization Experimental tests: - Kinetics of fibrillization process different exponential growth time and plateau phases; - 6-aminoindole = strongest inhibitory effect - 4-(2-aminoethylaniline) = weakest effect - Morfology analysis by AFM different length and distribution - Ultra-structural analysis for 6-aminoindole: - fibrils more isolated - after 100 h no mature fibrils (60 h in Tashiro et al., 2008) consistently with MD predictions

  18. Overview • Modulation of alpha-synuclein aggregation by dopamine analogs (Latawiec D. et al., PLoS ONE, 2010) • Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants Structural studies of alpha-synuclein and splicing variants

  19. Known isoforms Polymeropoulos MH et al., Science, 1997 Exon 3 Exon 1 Exon 2 Exon 4 Exon 5 Exon 6 A T Mouse a-syn Rat a-syn 1 S N L M N G A Y Rat a-syn 2 Rat a-syn 3 Human a-syn 140 DN GS Human a-syn 126 Human a-syn 112 Human a-syn 98 Adapted from MacLean PJ et al., Neurosci. Lett., 2002

  20. Lab. Prof. S. Gustincich, SISSA 100-140 116-140 127-140 3 possible peptides a-syn N-term a-syn C-term Alpha synuclein – isoform D2 Empty Structural correlation with full-length alpha-synuclein? D2 Full-length

  21. Chirality index (G) Pietropaolo A. et al., Proteins, 2008 dividing up the entire backbone in fragments and computing for each of them a chirality index (G) calculated from the backbone atoms Istantaneous values along MD trajectories Flexibility

  22. Coil states have a chiral nature Pietropaolo A. et al., submitted Coil states: absence of correlation among consecutive f and y dihedrals Smith L. et al., Fold. Des., 1996 Protein structures adopt a defined chirality in coil states instead of a random orientation

  23. Computational procedure A T S N L M N G A Y DN GS MD  30 ns/conformation  180 ns 6 mouse alpha-synuclein conformations

  24. Results – Molecular dynamics (full-length) RMSD Cluster analysis (10 Å cutoff) Chirality index and standard deviation

  25. Results – Peptides G – 60 ns G – 120 ns SD – 180 ns G – 180 ns

  26. Discussion • carboxy-terminal truncated alpha-syn proteins aggregate faster than the full-length molecule (Murray A. et al., Biochemistry, 2003) Proteolysis has also a role related to C-terminal peptide production? • homology with chaperon 14-3-3 family (Beyer K., Acta Neuropathol. 2006) • Regulation of aggregation due to acidic net charge and to formation of intramolecular contacts (Hoyer W. et al., Biochemistry, 2004) Binding to other proteins or cationic compounds Differential expression of the splicing variant could be related to disease susceptibility, having a protecting role

  27. In progress: influence of mutations S87N L100M N103G A107Y D121G N122S Study of combined mutants: A53T + G – 180 ns

  28. In progress: “Fold factor” Pietropaolo A. et al., submitted Parameter which uses native protein chirality to properly discriminate folded from unfolded conformations Conditional probability All correlation maps

  29. NGF-TrkA

  30. Thanks • Lab. Prof. Legname (SISSA) • Lab. Prof. Gustincich (SISSA) • Pietropaolo (UniCT) • Prof. Carloni (GRS)

  31. La potenziale produzione di un peptide di queste caratteristiche, a partire da un’isoforma di splicing alternativo, costituirebbe un’eventualità molto interessante. Una delle modifiche post-traduzionali a cui l’α- sinucleina è soggetta consiste proprio nel taglio proteolitico della porzione C-terminale, che determina la produzione di forme proteiche maggiormente tendenti all’aggregazione ed alla fibrillazione *Murray et al. 2003]. Lo studio di questa modifica post-traduzionale si è sempre concentrata sulla porzione maggiore della proteina, quella rimanente al N-terminale, ma non si è mai indagato sul peptide generato dal taglio. Se questo peptide fosse prodotto in vivo, si potrebbe ipotizzare che il taglio subito dall’α-sinucleina possa avere un significato funzionale anche in relazione al peptide di dimensione minore. In considerazione dell’omologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006], si può ipotizzare che questo peptide possa svolgere un’attività simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici, in virtù del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al. 2004].Queste interessanti osservazioni hanno suggerito di verificare la produzione di tale peptide in vitro, un evento che potrebbe suggerire ipotesi circa l’attività funzionale del trascritto Δ2. Per poter effettuare questa valutazione, si è reso necessario il trasferimento del costrutto di interesse in un vettore per l’espressione in cellule eucariotiche, pcDNA 3.0. All’interno di questo vettore sono stati clonati sia la forma deleta per l’esone due, sia quella full length dell’α-sinucleina, a partire dal primo esone distale.

  32. 4.3.1.2 L’analisi per immunofluorescenzaL’indagine per immunofluorescenza, oltre a consentire una valutazione qualitativa dell’espressione proteica, è primariamente finalizzata alla stima dell’efficienza di trasfezione, la quale risulta essere all’incirca del 70%, con livelli comparabili tra le due forme di α-sinucleina.Per eseguire questa analisi, le cellule sono state coltivate sulla superficie di vetrini per microscopia e quindi trasfettate con 1.6 μg di DNA. Al termine delle 24 ore, le cellule hanno subito un processo di fissazione con paraformaldeide e sono, quindi, state incubate con due diversi anticorpi, i quali, pur essendo entrambi capaci di riconoscere l’α-sinucleina, differiscono per la regione di legame. Dal momento che la forma Δ2 rappresenta l’ultima parte della proteina, un anticorpo diretto verso la porzione C-terminale102(visualizzato in verde nella figura 4.24) sarà in grado di riconoscere sia questo peptide, sia la forma FL. Se si impiega, invece, un anticorpo specifico per la parte N-terminale della sequenza (caratterizzato da colorazione rossa nella figura 4.24), solo l’isoforma intera dell’α-sinucleina potrà essere riconosciuta.Le immagini dimostrano una buona efficienza di trasfezione e documentano come il peptide relativo all’isoforma di splicing Δ2 sembri essere prodotto dalle cellule della linea HEK-T 293 trasfettate.

  33. 4.3.1.3 L’analisi per Western BlottingAlla luce di quanto appena riportato, si prosegue l’indagine dell’espressione proteica in vitro dell’isoforma di splicing Δ2, mediante Western Blotting. Per questo studio, sono state nuovamente impiegate le cellule della linea HEK 293T, coltivate su piatti Petri da 60 mm e trasfettate con 8 μg di vettoreDAPIMergeα-sinucleina N-termα-sinucleina C-termEmptyΔ2FL103vuoto, di isoforma Δ2 e di α-sinucleina full length. Dopo 24 ore dalla trasfezione, le cellule sono state lisate ed è stato raccolto l’estratto proteico totale, con cui è stata effettuata l’analisi di Western Blotting.Per visualizzare le bande relative alle due forme di α-sinucleina è stato impiegato il solo anticorpo diretto contro la porzione C-terminale. La differenza di peso molecolare risulta, infatti, sufficiente a discriminare tra le due, che pesano rispettivamente 17 kDa, la forma completa, e 4,6 kDa, la variante Δ2.Come si osserva in figura 4.25, solo la forma FL della proteina viene visualizzata sulla lastra fotografica e non appare nessun segnale all’altezza corrispondente all’isoforma di splicing. Per quanto si sia cercato di ottimizzare la tecnica a favore di proteine a basso peso molecolare, ad esempio utilizzando gel a gradiente, membrane di PVDF per il trasferimento delle proteine e variando le modalità di blotting, nessun tentativo ha consentito di ottenere la banda relativa al peptide di interesse.

  34. In considerazione dell’omologia presentata da questa regione con la famiglia delle chaperonine [Beyer 2006], si può ipotizzare che questo peptide possa svolgere un’attività simile nel confronto di altre proteine o che possa legarsi a composti cationici, in virtù del suo carattere fortemente acido [Hoyer et al. 2004].

  35. Questa seconda eventualità risulterebbe di grande interesse, perché potrebbe suggerire per questi peptidi un’attività simile agli chaperoni, in considerazione dell’alta omologia strutturale di questa regione dell’α-sinucleina con la famiglia 14-3-3 degli chaperoni. È stato ipotizzato che la porzione C-terminale sia capace di attenuare la tendenza aggregativa dell’α-sinucleina, dato che sono state osservate nei pazienti affetti da Parkinson forme tronche della proteina, mancanti proprio dell’estremità C-terminale, maggiormente prone al processo fibrillogenico. Se questi trascritti fossero davvero codificanti per peptidi corrispondenti a questa regione, si potrebbe immaginare che l’espressione differenziale di queste forme tronche sia associata ad123una maggiore o minore predisposizione alla malattia di Parkinson, per l’attenuazione del processo aggregativo dell’α-sinucleina.

  36. In particular, Alanine map [a] shows a high correlation, with a strong minimum centered at negative values, typical of α helix and in lower extent less positive values. Proline residue possesses a spread map [b], showing many positive values and highlighting the left-handed helix dihedrals of Poly-L-proline II conformation. The map of methionine, recently reported to interplay protein–protein interactions20, shows an extra–diagonal peak at [+0.15, +0.03] values of chirality index, as inferred from Figure 2[c], which is absent in the cysteine map of Figure 2[d].

  37. Once all the correlation maps of native chirality are obtained, we have used them for calculating a quantity to discriminate folded from unordered structures, as expressed in the following:kT NGdataset Fold factor = NG 􏰁i=1 −logP(Gi+1,Gi,AA)(1)where NG is the number of chirality indexes along a protein backbone, dataset refers to both Xray and NMR protein structures and kT is 0.6 Kcal/mol at 300 K. P(Gi+1,Gi) is the conventional joint probability of finding residue i + 1 and i, with Gi+1 and Gi values, in the correlation maps of native chirality. Since we are summing energy quantity, the probability taken into account are not conditional, like those reported in Figure 2 [a]-[d], but normalized as conventional joint probability.

  38. Random structures of lysozyme, instead, show high values, whose spread entity depends on how many residues do not possess Gi, Gi+1 values in the correlation map of native chirality for a given amino acid i and thus on how many residues adopt disfavored chirality values. Supporting its effectiveness, the NMR structure of lysozyme (1E8L) shows a low value of fold factor, comparable to that one of SCOP classes. Moreover, an intriguing result was found by analyzing structures of the intrinsically disordered gamma-subunit of cGMP phosphodiesterase (pdb code 2JU4) as the values of the fold factor are found to be spread out and to have positive energies, in accordance with the recent contribution of Liu et al.21. The fold factor of this intrinsically disordered protein is lower than those found in random lysozyme, which indicates a dynamical but not random conformational ensemble.

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