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UBA III – Biologia Molecular

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UBA III – Biologia Molecular. Aula Laboratorial 1 2012/2013. Maria José Correia [email protected] Sumário L1. Apresentação sucinta do programa das aulas laboratoriais; Segurança no laboratório Introdução às técnicas básicas para o estudo dos ácidos nucleicos

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uba iii biologia molecular

UBA III – Biologia Molecular

Aula Laboratorial 12012/2013

Maria José Correia

[email protected]

sum rio l1
Sumário L1
  • Apresentação sucinta do programa das aulas laboratoriais;
  • Segurança no laboratório
  • Introdução às técnicas básicas para o estudo dos ácidos nucleicos
    • Isolamento e purificação de DNA
    • Digestão de DNA:
      • Digestão de DNA do bacteriófago λ com enzimas de restrição.

UBA-III Biologia Molecular 2012/2013

programa
Programa

UBA-III Biologia Molecular 2012/2013

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Segurança no laboratório

UBA-III Biologia Molecular 2012/2013

  • Regras gerais:
    • Nunca trabalhar sozinho!
    • Nunca COMER, BEBER, FUMAR, aplicar lentes de contato ou cosméticos!
    • Nunca cheirar soluções ou reagentes
    • Nunca pipetar com a boca
    • Lavar imediatamente a pele após contato com culturas/químicos
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Segurança no laboratório

UBA-III Biologia Molecular 2012/2013

  • Atitudes:
    • Usar o senso comum (a maioria dos acidentes de laboratório começa com algo simples);
    • Estar consciente – conhecer os reagentes antes de os usar (ler os rótulos, etc.)
    • Estar protegido – conhecer as práticas e equipamentos que podem aumentar a proteção (máscaras, luvas, etc.)
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Segurança no laboratório
  • Bancada:
    • As bancadas de trabalho devem ser mantidas organizadas e limpas
    • Identificar todo o material utilizando para isso marcadores de vidro apropriados
    • Os lixos devem ser perfeitamente identificados
    • O material de vidro estalado ou partido deve ser imediatamente rejeitado

UBA-III Biologia Molecular 2012/2013

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Segurança no laboratório
  • Protecção pessoal:
    • Usar bata e manter os cabelos compridos apanhados;
    • Usar a hotte sempre que necessário;
    • Antes de abandonar o laboratório , limpar a bancada, retirar a bata e lavar as mãos.

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Instruções gerais

UBA-III Biologia Molecular 2012/2013

Ler os protocolos antes de cada aula prática

Seguir atentamente as instruções fornecidas pelo docente antes de executar o trabalho proposto

Depois de terminar o trabalho de cada aula arrumar a bancada. Colocar o lixo e o material contaminado nos locais apropriados.

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Introdução às técnicas para estudar os ácidos nucleicos
  • Manipulação de moléculas de DNA
    • Isolamento e purificação de DNA genómico
    • Enzimas de restrição
    • Separação em gel de agarose
    • Aplicações biotecnológicas

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Técnicas de extração de DNA genómico
  • DNA
    • lise celular
    • libertação de todo o material intracelular
    • precipitação de proteínas e detritos celulares
    • purificação do DNA

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Lise celular
  • Lise mecânica/física
    • Homogenizador
    • Ultra-sonicador
    • French pressure cell press
    • Fervura e pressão osmótica
  • Lise alcalina
    • soluções fortemente alcalinas (de hidróxido de sódio)
    • SDS (dodecil sulfato de sódio)
  • Lise enzimática
    • Proteases
    • Rnases

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Precipitação diferencial
  • Fenol/Clorofórmio/Álcool isoamílico
    • Fenol e clorofórmio desnaturam as proteínas
    • Fase fenólica (proteínas em solução) separa-se da fase aquosa (DNA)
  • Precipitação com etanol absoluto (ou isopropanol)
    • Insolubilidade do DNA em etanol
    • Presença de catiões monovalentes
  • Lavagem com 70% etanol
    • Dissolução dos catiões
    • DNA puro no precipitado

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Extração de ácidos nucleicos

amostras diversas

lise celular

Precipitação de proteínas

Lavagem e precipitação de DNA

Ressuspensão do DNA em TE (pH8.0) ou em água estéril

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Determinação da concentração e grau de pureza
  • Método espetrofotométrico
    • A absorvância a 260nm é proporcional à quantidade de ácidos nucleicos
    • A absorvância a 280nm que é proporcional à quantidade de proteínas e fenol
    • O grau de pureza é frequentemente estimado através da razão A260/A280 que deve ser entre 1,8 e 2,0

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Separação de diferentes fragmentos de DNA em função da sua mobilidade num campo eléctrico

Eletroforese em gel de agarose

http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Biotecnologia/eletroforese.php

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Enzimas que reconhecem pequenas sequências de DNA (4 a 8 nucleótidos)

Cortam o DNA de cadeia dupla no interior dessa sequência ou num local adjacente a ela.

Catalisam a quebra de uma ligação fosfodiéster entre dois nucleótidos consecutivos.

Geram dois fragmentos cujos terminais podem ser:

coesivos

cegos

Endonucleases ou enzimas de restrição

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Isosquisómeros
  • reconhecem e cortam a mesma sequência

MboI GATC

NdeIIGATC

Neosquisómeros

  • reconhecem a mesma sequência mas cortam ligações distintas.

SacI GAGCTC

EcoICRI GAGCTC

Enzimas de restrição

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Célula bacteriana

DNA E. coli

Entrada do DNA λ

Ciclo lisogénico

Ciclo lítico

Fago λ

Replicação do DNA λ

DNA λ

activação

DNA λ integrado no

genoma bacteriano

Lise bacteriana e libertação do DNA λ

Neste trabalho…

  • Bacteriófago λ
  • (≈ 48,5 pb)
  • Enzimas de restrição
  • (Produzem terminais coesivos)

análise dos padrões de restrição

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L = DNA λ

P = PstI (Digestão do DNA λ)

E = EcoRI (Digestão do DNA λ)

H = HindIII (Digestão do DNA λ)

Amarelo

Violeta

Verde

Laranja

Enzimas de restrição

Preparação das amostras

  • Colocar as amostras em gelo:
  • Identificar os tubos para as reacções de digestão

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37ºC

Tubo DNA RB PstI EcoRI HindIII

Preparação das amostras

  • Pipetar os reagentes de acordo com a tabela :

Micropipetas!!!

  • Misturar os reagentes e incubar a 37ºC, durante 30 minutos

Trazer régua na próxima aula

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