Sapienza Università Roma

1. Sapienza Università Roma Corso di Laurea Magistrale in Biologia Cellulare Dipartimento di Biologia Ambientale SVILUPPO DI UN BIOSENSORE PER RIVELARE LA CHEMILUMINESCENZA PRODOTTA MEDIANTE REAZIONE A SANDWICH DI APTAMERI SPECIFICI PER L’ OCRATOSSINA A, INTEGRATO IN UN SISTEMA LAB-ON-CHIP Relatore: Massimo Reverberi Candidata: Cristiana Sberna

2. Ocratossina A • Funghi produttori: Aspergillus e Penicillum • Contaminante di cereali, caffè, frutta secca, spezie, mangimi vino e birra • Nefrotossica, epatotossica, teratogena e immunotossica per molte specie animali. Per l’uomo “possibile agente cancerogeno”. • Limiti UE tra 1 e 10 ppb • Fluorescenza intrinseca

3. Tecniche maggiormente utilizzate per l’identificazione di OTA

4. Le caratteristiche strumentali richieste dal mercato: • Sensibilità • Bassi costi • Rapidità • Risultati quantitativi • Detection multipla • Portabilità • Semplicità

5. lab-on-chip • Diverse funzioni di laboratorio integrate in unico chip • Canali microfluidici • Ridotto consumo campioni e reagenti • Facilità utilizzo • Rapidità analisi • Elevata riproducibilità • Analisi in campo e in tempo reale • Integrazione con array : analisi simultanea di diversi analiti

6. Aptameri come biosensori • Corte sequenze nucleotidiche a singolo filamento di DNA o RNA artificiale • SELEX(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment) • Catturano con grande affinità e specificità molecole target (amminoacidi, piccoli peptidi, proteine, ioni metallici, tossine, batteri, virus, cellule intere) • Marcatori sangue, urine • Cellule malate • Tossine • Microrganismi • Antibiotici • Pesticidi • Batteri • Metalli pesanti

7. Caratteristiche aptameri • Catturano la molecola target • Non immunogenici • Sintesi chimica a basso costo di produzione ed in pochi minuti • Potenziale selezione verso qualsiasi target • Facilmente modificabili • Stabilità della struttura 3D in diverse condizioni sperimentali • Interazione Aptamero- molecola target reversibile senza perdita di specificità

8. AptameriOTA-specifici

9. Saggi basati su aptameri • Elettrochimici • Ottici • Mass-sensitive

10. Scopo della tesi Sviluppare un dispositivo lab-on-chip per quantificare i livelli di OTA presente in derrate alimentari Metodo analitico prescelto: saggio chemiluminescente quantitativo (ALISA: aptamer-linkedimmobilizedsorbentassay)  sandwich tra aptameri • set up di rapidi metodi estrattivi da matrici alimentari per OTA • Funzionalizzazione superficie vetro • Formazione canali microfluidici e fotosensori

11. Formazione del pattern PHEMA brush linee di 100 μm : • Fotolitografia • Soluzione “Piranha”: H2SO4 – H2O2 (3:1) • Plasma ossigeno • Distribuzione del “photoresist” SU-8 • Esposizione con maschera ai raggi UV • Soluzione di sviluppo oppure quadratini da 4 mm2:

12. Funzionalizzazione del polimero Funzionalizzazione del polimero Scopo della tesi c b a Aptamer 1.12.2 OTA NH2 NH2 FLUO Aptamer 1.12.2- -Fluorescein (FLUO) FLUO FLUO d

13. Verifica di immobilizzazione dell’aptamero al PHEMA funzionalizzato mediante microscopia a fluorescenza NH2-5’GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA- Fluoresceina Nessuna fluorescenza quando aptamero reagisce con PHEMA-SA-NHS che ha reagito con etanolammina

14. Interazione PHEMA-aptamero- OTA Microscopia a fluorescenza • 20 μl OTA in HEPES • 20-200 ng Segnale fluorescenza dopo 10 min  PHEMA-etanolammina

15. Studio quantitativo intensità di fluorescenza • Curva di calibrazione • y=kx+q • y= intensità di fluorescenza • x= OTA • k= sensibilità • q= background 10min incubazione Intensity/ a.u. OTA/ ng 10-40 min incubazione Intensity/ a.u. OTA/ ng

16. Reversibilità interazione PHEMA-aptamero-OTA • OTA 40 ng, 40 min • dopo Me-OH, 10 min • Stabilità interazione PHEMA-aptamero-OTA dopo 1 settimana • Specificità legame PHEMA-aptamero-OTA (AFLA, OTA B 40 ng, 10 min)

17. Cattura di OTA da vino e birra • Matrice organica: vino Negramaroe birraTennent’s fortificati con 2 ng/μL di OTA • Soluzione estraente: acetato di etile acidificato all’ 1% con acido formico • Centrifugazione • Prelievo fase organica (OTA) • Matrice portata a secco e ridisciolta in HEPES • Analisi campioni HPLC

18. Cattura di OTA da vino e birra • ESTRATTI incubati con PHEMA-aptamero 10 min y=kx+q Vino: (1.87±0.2) ng/μl (1.96±0.04) ng/μl HPLC Birra: (1.7±0.18) ng/μl (1.6±0.02) ng/μl HPLC Intensity/ a.u.

19. Detection di OTA mediante chemiluminescenza • ALISA (aptamer-linkedimmobilizedsorbentassay) • Fotolitografia • 30 quadratini 4 mm² • PHEMA-aptamero (1.12.2) • 2 μl OTA (1-20 ng) su ogni quadratino, 10 min

20. AptameroA08-biotin o 1.12.2-biotin, 10 min • Avidina-HRP, 10 min • Cocktail chemiluminescente(luminolo+ H₂O₂), 30 s • Misure segnale chemiluminescente : CAMERA DIGITALE con detector CMOS in mini camera oscura

21. No OTA OTA 4 ng

22. Intensità del segnale di chemiluminescenza in funzione della concentrazione di OTA Intensity/ a.u. Intensity/ a.u. OTA/ ng OTA/ ng A08-biotin 1.12.2-biotin

23. Misura della chemiluminescenza mediante FOTORIVELATORI • 30 quadrati neri (4 mm²) di silicio amorfo su vetro • Variazione luce  variazione corrente di buio DISPOSITIVO MICROFLUIDICO • Canali: • larghezza 1.5 mm • altezza 50 μm • lunghezza 3 cm

25. Conclusioni … • Funzionalizzazione superfici di vetro con PHEMA brush; modifica chimica del polimero per immobilizzare l’aptamero specifico per OTA; specificità, stabilità, reversibilità legame PHEMA-aptamero-OTA • La quantità di OTA immobilizzata dipende dalla concentrazione della soluzione e dal tempo di incubazione • PHEMA-aptamero cattura OTA da matrici alimentari (vino e birra) • Saggio chemiluminescente; misure mediante camera digitale e sensori; dispositivo microfluidico • Aumento lineare segnale per OTA tra 1 e 4 ng e decade a 10-20 ng (…)

26. … prospettive future • matrici solide • nuove micotossine • analisi in campo • personale non specializzato

27. RINGRAZIAMENTI Al Dott. Massimo Reverberi e Dott. Cristiano Bello del Dipartimento di Biologia Ambientale della Sapienza Università di Roma. Alla Dott.ssa Francesca Costantini e al Prof. Cesare Manetti del Dipartimento di Chimica della Sapienza Università di Roma. Ai Prof. Domenico Caputo, Giampiero De Cesare, Augusto Nascetti e a Giulia Petrucci del Dipartimento di Ingegneria dell’Informazione, Elettronica e Telecomunicazioni della Sapienza Università di Roma.

28. SELEX (SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment)