1. Modell • Hairpin gir RNA pol pause og induserer konformasjonsendring i enzymet • RNA henger nå bare svakt i templat via dA-rU og dissosierer • Forutsagt effekt av GTP til ITP (svekket terminering) • Flere andre forhold bidrar • Kontekst, NTP, supercoil osv

2. Assistert terminering - rho-avhengig • Noen termineringsseter krever en hjelpefaktor (rho-faktor) • Rho = Hexamer NTPase som katalyserer opptvinning (unwinding) • Modell • Rho binder RNA oppstrøms via et spesifikt motiv, migrerer mot polymerasen, opptvinning, frigjøring av transkript

3. Rho factor. Page 1231 The Rho protomer with its N-terminal domain cyan, its C-terminal domain red, and their connecting linker yellow.

4. Rho factor. Page 1231 The Rho hexamer. Its six subunits, each of which are drawn in a different color, form an open lock washer-shaped hexagonal ring.

5. Rho factor Page 1231 The solvent-accessible surface of the Rho hexamer as viewed from the top of Part b.

6. Hvordan regulere transkripsjon? • Behov for regulering: • Nivå: Noen mRNA trenges i store mengder, andre i små • Timing: Forskjellige mRNA trenges til ulike tidspunkt • Respons: Noen mRNA trenges bare i visse miljø (nærvær av ulike næringsstoffer) • Hvordan oppnås ulike transkripsjonsnivå?

7. Rask endringi prokaryoter • Koblet translasjon /transkripsjon gir respons innen minutter • Translasjon av mRNA før transkripsjon er ferdig • mRNAs levetid også kort (1-3min)

8. Enkel regulering av NIVÅ via ulike optimale promotere • lacI genet er lavt uttrykt pga svak promoter (avvik fra consensus) <10 mlk pr celle Svak Svak 10000 mlk pr celle Sterk Sterk

9. Regulering av TIMING- serie av sigma-faktorer • Utvikling/differensiering = tidsmessig ordnet ekspresjon av gen-programmer • Fag-infeksjon - enkel modell for slik timing • Early - middle - late genes • B.subtilis infisert av fagen SP01 • Early genes - via vertens RNAP/s - normale promotere • Et tidlig produkt = sgp28 en ny s med endret promoterpreferanse • Middle genes - via vertens RNAP/sgp28- egne promotere • Late genes - via vertens RNAP/sgp33/34- egne promotere

10. Regulering av RESPONS- via repressorer (og aktivatorer) • Prokaryot transkripsjons-regulering via tre elementer: • Promotere gjenkjennes av RNA polymerasen • Operatorer gjenkjennes av repressorer • Positive kontrollelementer gjenkjennes av aktivatorer

11. Logikk: ”Grunntilstand” ulik i pro- versus eukaryoter • Grunntilstand • Aktiviteten av en promoter in vivo i fravær av regulatoriske sekvenser og aktivatorer/repressorer • Prokaryoter: grunntilstand = åpen • Ingen begrensning på RNA polymerasens tilgang til promotere • Repressorer blokkerer tilgang • Aktivatorer kun nødvendige på visse svake promotere • Eukaryoter: grunntilstand = lukket (pga kromatin) • En sterk core-promoter alene er inaktiv i eukaryoter • De fleste eukaryote gener krever aktivatorer

12. Logikk: ”Grunntilstand” ulik i pro- versus eukaryoter Prokaryoter Eukaryoter

13. Lac operon Eksempel på repressorregulering av promotertilgang

14. Induksjon- tilpasning til næring • E.coli lager enzymer for laktosefermentering kun når laktose er til stede • + lactose - rask induksjon av • galaktosid permease • ß-galaktosidase • Inducer = 1,6-allolactose • Lab:IPTG

15. Genetisk kartlegging • Operon • Strukturelle gener • Proteinkodende • Operator • Bindingssekvens for regulator • Promoter • Bindingssekvens for RNA polymerase

16. Evidens for repressor • Konstitutive mutasjoner – lac-operonet aktivt i fravær av inducer • Mutasjon mappet til lacI genet • lacI ligger utenfor operonet • lacI virker i trans via kodet protein-produkt (lac repressor) • Oc mutasjoner samme effekt men virker i cis (operator mutasjon)

17. Konjugasjon - evidens for at lacI virker i trans I+Z+ I-Z- Uten inducer ß-gal syntese starter pga Z+ Represjon forsinket Pga lacI virker i trans

18. The nucleotide sequence of the E. coli lac promoter–operator region. Page 1239

19. Systemet • Uten inducer: AV • Lac-repressor binder operator • Med inducer: PÅ • Lac-repressor inaktiveres av inducer

20. Lac repressor Kd = 10-13M • Tetramer • Hver monomer binder IPTG • DNA gjenkjenning via sliding • Raskere enn diffusjon IPTG Kd = 10-6M

21. Mekanisme for Lac represjon • Lac operator og promoter overlapper - trolig at repressor blokkerer tilgang for RNA pol • Likevel, noe mer

22. X-Ray structure of the lac repressor subunit. Page 1248

23. X-ray structure of the lac repressor-DNA complex. Page 1249

24. NMR structure of the lac repressor-DNA complex. Page 1249

25. Model of the 93-bp DNA loop formed when lac repressor binds to O1 and O3. Page 1250

26. Katabolittrepresjon Eksempel på aktivering av gener via CAP-cAMP komplekset

27. Glukoses forrang • Glukose foretrukket metabolitt • Katabolitt represjon • nærvær av glukose hindrer uttrykk av gener nødvendige for annen fermentering (laktose, arabinose, galaktose) • Hvordan senses høy/lav glukose? via cAMP! • Glukose senker cAMP-nivået

28. Eksempel på katabolittrepresjon – lac-operonet • Lac-operonet ”skrus på” av laktose • Lac-operonet ”skrus av” av glukose Katabolitt represjon Induksjon

29. CAP eller CRP 90o • Respons overfor cAMP skjer via CAP • = Catabolite gene activator protein • Kalles også CRP (cAMP receptor protein) • cAMP-bindende dimer • Endrer konformasjon ved binding av cAMP

30. Mekanisme for aktivering? • CAP kan kontakte RNA pol direkte • CAP binder oppstrøms initieringskompleks • De to bindes i løsning • CAP endrer DNA-konformasjonen • 90o indusert bøyning - endrede relative posisjoner • Major groove lukkes, minor åpnes • CAPs effekt gjenskapes av DNA-sekvenser som spontant bøyes

31. x CAP RNApol. To mulige mekanismer • Posisjon • Bøyning

32. X-Ray structures of CAP–cAMP complexes. (a) CAP–cAMP in complex with a palindromic 30-bp duplex DNA. Page 1241

33. X-Ray structures of CAP–cAMP complexes. (b) CAP–cAMP in complex with a 44-bp palindromic DNA and the aCTD oriented similarly to Part a. Page 1241

34. X-Ray structures of CAP-cAMP complexes. (c) CAP dimer’s two helix-turn-helix motifs bind in successive major grooves of the DNA. Page 1241

35. Sekvens-spesifikk DNA-binding Prinsipper og eksempler

36. Hvordan gjenkjennes sekvens fra utsiden? Elektrostatisk interaksjon Form/ geometri Hydrogen- bindinger Hydrofob interaksjon

37. Komplementære former • Dimensjonen tilheliks passer dimensjonene i major groove av B-DNA • Sidegruppene peker utover og er gunstig plassert for dannelse av hydrogenbindinger

38. D A A Gjenkjenning via hydrogenbinding • Hydrogenbinding er sentral for spesifikk gjenkjenning • Hydrogenbindingspotensialet er ikke uttømt i dupleks DNA, ledige seter peker ut mot major groove

39. Heliks-turn-heliks (HTH) motiv er vanlig i prokaryoter • HTH = 2 a-helikser (120o kryss) • 2.heliks = gjenkjenningsheliks 434 fag repressor

40. Et lignende eksempel - Cro protein fra 434 fag

41. Indirect read-out?

42. Unntak: DNA-binding via b-ribbon • Met repressor • Arc repressor

43. Arabinose-operonet

44. Stort oppstrøms kontrollområde

45. Kontroll via looping

46. X-Ray structure of E. coli AraC in complex with L-arabinose. Page 1247

47. Trp operon Eksempel på regulering via både initiering og terminering

48. nivå:repressor + corepressor • Trp repressor binder tryptofan og styrkes som repressor • Logikk: når Trp tilgjengelig, reduseres syntese • TrpR + Trp binder operator og inhiberer operonet 70-fold • Trp = korepressor (økt represjon) • ≠ inducer som svekker represjon

49. Trp repressor- indusert DNA-binding • Trp repressor binder sin operator kun i nærvær av tryptofan (rød)

50. Trp repressor