SPECIÁLNÍ METODY PŘI ZPRACOVÁNÍ A BARVENÍ TVRDÝCH TKÁNÍ

1. SPECIÁLNÍ METODY PŘI ZPRACOVÁNÍ A BARVENÍ TVRDÝCH TKÁNÍ Nezhybová E., Kašpárková E., Machalová B., Wagner F. Ústav histologie a embryologie Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci

2. Úvod • tvrdé tkáně představují pro běžná histologická vyšetření komplikaci s ohledem na nutnost demineralizace tkáně • k tomuto účelu slouží zředěné kyseliny, které přeměňují nerozpustné soli v soli rozpustné ve vodě • k zachování struktury a použitelnosti tkáně je nutné přesně dodržovat správné postupy

3. Cíle práce • cílem naší práce bylo srovnat některé demineralizační postupy, poskytnout přehled speciálních barvení využitelných pro tvrdé tkáně a stanovit možnosti imunohistochemických vyšetření na tvrdých tkáních, které byly demineralizovány

4. Materiál a metodika • jako materiálu jsme použili dospělých lidských zubů a kostí • k dekalcifikaci jsme používali: • elektrolytické odvápňování • chelaton III • Löwyho roztok • jako barvících postupů jsme používali H.E., Schmorlovu reakci, azan, zelený trichrom, PAS a Saturnovou červeň • dále jsme prováděli imunohistochemické reakce

5. Dekalcifikace (1) • doba se řídí velikostí bločku a typem dekalcifikační tekutiny • stupeň odvápnění určujeme vbodnutím jehly nebo chemicky /k 5 ml dekalcifikační tekutiny slité z odvápňované tkáně se přidá 5 ml 5% roztoku hydroxidu amonného a 5 ml 5% roztoku šťavelanu vápenatého/

6. Základní pravidla demineralizace • tkáň musí být dobře fixována, jinak dochází k poškození tkáně (bobtnání) • důkladné vyprání tkáně po fixaci ve vodě nebo etanolu • odvápnění musí být rychlé /dostatečné množství dekalcifikační tekutiny, pravidelné vyměňování/ • po odvápnění nutné dokonale vyprat tkáň od dekalcifikační tekutiny /nikdy nesmí ovšem přijít tkáň z dekalcifikačního roztoku do vody/

7. Dekalcifikace (2) • elektrolytické odvápnění • kyselina mravenčí, kyselina chlorovodíková, destilovaná voda • chelaton III • kyselina etylendiamintetraoctová (EDTA) • Löwyho roztok • 40% formaldehyd, chlorid rtuťnatý, ledová kyselina octová, destilovaná voda

8. Barvení tkáně • hematoxylin – eosin (HE) • Schmorlova reakce • Saturnová červeň • zelený trichrom • azan • PAS

9. substrát (DAB) II. protilátka SA-P I. protilátka buněčný antigen Imunohistochemie Nepřímá třístupňová imunohistochemická reakce, při které jsme použili primární protilátky proti kolagenu a Ab-1 (na makrofágy)

10. Výsledky - dekalcifikace • nejkratší dobu trvání má dekalcifikace v Löwyho roztoku (cca 20 hodin), který je současně fixační tekutinou a výsledná barvení neovlivňuje, současně je vhodný i pro imunohistochemické zpracování tvrdé tkáně • elektrolytické odvápnění je rovněž účinné, trvá několik dní a není k tvrdé tkáni příliš šetrné • EDTA trvá několik měsíců, ale je nejšetrnější, dosáhnout zkrácení doby odvápnění lze přidáním 2% kyseliny mravenčí, poté je nutné tkáň vyprat v 5% roztoku formaldehydu

11. Zub – hematoxylin/eosin

12. Zub – Schmorlova reakce

13. Zub - azan

14. Zub – Goldnerův zelený trichrom

15. Zub - PAS

16. Zub – Saturnová červeň

17. Zub – ukázka imunohistochemie

18. Závěry (1) • použití různých typů dekalcifikačních tekutin ovlivňuje délku demineralizace • Löwyho tekutina usnadňuje postup, protože je současně i tekutinou fixační, jde o postup z hlediska odvápnění nejkratší a dostatečně šetrný • chelaton III (EDTA) je postup dlouhý a pro rutinní laboratoř nevhodný

19. Závěry (2) • při barvení tvrdých tkání lze použít různých speciálních postupů, které poskytují specifické výsledky a umožňují zobrazit potřebné jednotlivé struktury • při šetrné dekalcifikaci lze na odvápněné tkáni úspěšně provádět imunohistochemická vyšetření, je ale třeba zvolit vhodný dekalcifikační prostředek

20. Děkujeme za pozornost 