Klinická cytogenetika - metody

1. Klinická cytogenetika - metody OLG FN Brno

2. Cytogenetické barvící metody Bandy=pruhy-části chromozomů, které jsou zřetelně odlišeny od sousedních segmentů za použití více metod Metody diferencující po celé délce: Q-pruhy: fluorescenční barvení, jasné pruhy=oblasti s DNA bohatou na AT, AT oblasti zvyšují fluorescenci, GC ji potlačují, nevýhoda metody-rychlé blednutí preperátů, foto G-pruhy: mechanismus nejasný, důl. role Giems. barviva, enzymat. působení trypsinu, afinita u histonů bohatých na arginin, DNA ani proteiny nemizí při působení trypsinu, trvalé preparáty R-pruhy: reverzní ke G, princip-vysoká teplota (85C), denaturace proteinů a DNA bohaté na AT, GC oblasti zůstávají v nativní konfiruraci (delece koncových úseků)

4. Metody selektivní C-pruhy: barvení konstitutivního heterochromatinu, denaturace NaOH, vyplavení fragmentů DNA z chromozomu do roztoku 2xSSC NOR: barvení oblastí, které v interfázi tvoří jadérko (nukleolární organizátor jadérka)-mnohonásobné kopie genů pro rRNA, akrocentr. chr., AgNo3 SCE: výměny sesterských chromatid, reciproké výměny, nemění morfologii Ch. výměny v homologních místech, mechanismus neznámý, vznik během replik. DNA, vztah k reparaci DNA, nesouvisí se vznikem strukturních aberací inkukce: alkylačními činidly, UV zářením použití: citlivý indikátor mutagenů výskyt: Bloomův sy. princip metody: inkorporace BrdU 2x buněčný cyklus, afinita fluorescenčního barviva Hoechst 33258

7. FISH - fluorescenční in situ hybridizace Použití sondy komplementární ke sledovanému úseku DNA, denaturace, hybridizace Sondy značené: radioaktivně ( zač. 70. let ) fluorescenčně 1990 Typy sond: centromerické, telomerické , celochromozomové (malovací), genově specifické, multisondy, genomové Hodnocení: fluorescenční mikroskop počítačová analýza obrazu

8. Princip FISH

9. Typy sond Satelitní-hybridizace se satelitními sondami - centromerické  satelitní: centromery, tandemově se opakující monomer 171 bp (numerické aberace, interfázní jádra)  satelitní: pericentrické oblasti akrocentr. , tandemově se opakující monomer 68 bp (13,14,15,21,22,9) telomerické: specifické sekvence TTAGGG (telomer. delece PMR) Celochromozomové: hybridizují po celé délce chromoz. (translokace) Genově specifické: hybridizují jedinečné sekcence (mikrodelece, onko) Genomové:tvořeny celkovou DNA (CGH), detekce jen delecí a amplifikací, klon v 50%zastoupení, k upřesnění cílená FISH celochrom.

12. Modifikace metody FISH Sekvenční FISH: po sobě se opakující hybridizace na stejném preparátu (PGD) Multisondový systém: podložní sklo s 24 sondami ve 24 polích-mitozy Multicolor: vizualizace jednotlivých párů v oblišných barvách (24 specifických celochromozomových sond- obrazová analýza, pseudobarvy princip: kombinace 5 sond spektrálně se nepřekrývajících, postupné snímání obrazů a jejich syntéza požadavek: spec. software (pseudobarvy), komplexní hodnocení chromos. Aberací nevýhoda: sada úzkopásmových filtrů Spektrální karyotypování SKY: současná vizualizace všech chr. , emisní spektrum (Furierova transformace) výhoda: získání obrazu v 1 kroku, ekonomická úspora

13. mFISH: -X,+del(1p),t(2;15),+8,+8,-9,t(9;15),-10,- 11,+del(13q),+20,-22

14. t(2;13), t(4;8), t(6;16), t(8;11)

15. Nejnovější metody cenM-FISH: identifikace všech centromer současně centromerické sondy značené 5 různými fluorochromy použití: malé marker chromozomy MCB (multicolor banding): chromoz. charakterizovány barevnými pruhy po celé délce