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Cyclin E Ablation in the Mouse

Cyclin E Ablation in the Mouse. Seminario 3 Cell, August 2003. CICLO CELULAR EN EUCARIOTES. CICLO CELULAR. CONTROL DEL CICLO.

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Cyclin E Ablation in the Mouse

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Presentation Transcript

  1. Cyclin E Ablation in the Mouse Seminario 3 Cell, August 2003

  2. CICLO CELULAR EN EUCARIOTES

  3. CICLO CELULAR

  4. CONTROL DEL CICLO • REGULADORES POSITIVOS: Proteínas cinasa heterodiméricas que contienen una subunidad reguladora (Ciclinas A,B,D,E) y una subunidad catalítica (Cdk). Regulan la actividad de múltiples proteínas que participan en la replicación del DNA y la mitosis, a través de la fosforilación de las mismas en sitios reguladores específicos,con la activación de algunas y la inhibición de otras. • Las ciclinas D y E (o ciclinas G1) son proteínas que funcionan principalmente durante la fase G1 y en la transición de G1-S. • Las ciclinas A y B funcionan durante la fase S, G2 y mitosis temprana. • En células en G0 no hay expresión de ciclinas ni de Cdks.

  5. CONTROL DEL CICLO • REGULADORES NEGATIVOS: • Proteína RB (pRB):reprime la expresión genética de los reguladores transcripcionales E2Fs,que transactivan genes importantes para la entrada en S. • INK4:grupo de proteínas que bloquean la actividad cinasa-ciclina D dependiente (cdk4-cdk6) produciendo arresto en G1.Su expresión es tejido dependiente. • Inhibidores de cdk:proteínas p21,p27,p57. • P53:regulador arquetípico del ciclo y el gen más frecuentemente mutado en cáncer.asegura que frente a un daño genotóxico,las células se detengan en G1 y traten de reparar su DNA antes de la replicación.El gen de p21 es otro target de p53.En algunos tipos celulares si se sobreepresa induce apoptosis(genes suicidas BAX)

  6. D CICLINAS • Controlada por mitógenos extracelulares (factores de crecimiento). • Se asocian a cdk4 y cdk6,fosforilando pRB,lo que permite la deshinibición de los factores de transcripción E2Fs.,permitiendo el ingreso a S.

  7. E CICLINAS • Se cree que completan la fosforilación de pRB. • Independientes de la estimulación por mitógenos;controlada por mecanismos autónomos. • Pico en el límite G1/S. • Críticas para la proliferación de pRB-. • Sustratos putativos:proteínas involucradas en la iniciación de la replicación del DNA,proteínas que gobiernan la duplicación del centrosoma,biosíntesis de histonas y progresión del ciclo celular.

  8. Resúmen Se cree que las ciclinas tipo E (E1 yE2) dirigen la entrada a la fase S. Se ha asumido que estas dos ciclinas son críticas para la proliferación de todos los tipos celulares. Este trabajo demuestra que las ciclinas E son prescindibles para el desarrollo murino. Sin embargo, la ausencia de ciclina E altera severamente la endorreplicación de las células gigantes del trofoblasto y de los megacariocitos.Las células deficientes en ciclina E proliferan activamente en condiciones de ciclado contínuo,pero no son capaces de reingresar al ciclo desde G0,por no poder incorporar las prot.MCM al orígen de replicación durante la progresión G0-S. Se encontró también que las células deficientes son resistentes a la transformación oncogénica.

  9. GENERACION DE RATONES DEFICIENTES EN CICLINAS E1 Y E2 • Para realizar un testeo riguroso del requerimiento de las ciclinas E en el desarrollo y la oncogénesis,se generaron ratones que carecen de ciclina E1 o E2 delecionando el gen de interés en stem cells embrionarias. • En el caso de ciclina E1 se delecionaron los exones codificantes 2-11. • En el caso de E2, los exones codificantes 1-8. • Los ratones homocigotas ciclina E1-/- y E2-/- fueron generados utilizando métodos std., y la ausencia de los exones delecionados fue verificada por Southern Blotting.

  10. Transfección con construcción dirigida al gen E1 Generación de ratones deficientes en Ciclina E1 y Ciclina E2 Aislamiento de stem cells embrionarias WT Reemplazo de exones 2-11 por recombinación homóloga (se elimina fragmento Not I - Sca I de 10kb) Cultivo en medio de selección (medio + neomicina) 10/198 clones recombinaron en locus E1 Generación de ratones E1 +/-

  11. Transfección con construcción dirigida al gen E2 Generación de ratones deficientes en Ciclina E1 y Ciclina E2 Aislamiento de stem cells embrionarias E1 +/- Reemplazo de exones 1-8 por recombinación homóloga (se elimina fragmento Not I - Spe I de 14kb) Cultivo en medio de selección (medio + puromicina) 4/320 clones recombinaron en locus E2 Generación de ratones E1+/- E2+/- Por cruzamiento se obtuvieron los dobles homocigotas E1-/- E2-/-

  12. Digestión con ScaI y SpeI • Sonda cDNA E1 exones 4-12 y región 3´UTR • Digestión con EcoRI • Sonda cDNA E2 exones 1-6 E1 E2 2.6 7.6 9.0 Puro Neo 2.8 Generación de ratones deficientes en Ciclina E1 y Ciclina E2 Southern blot para verificar exones delecionados 1) Extracción de DNA genómico 2) Digestión con enzimas de restricción 3) Electroforesis en gel de agarosa 4) Desnaturalización del DNA 5) Transferencia a nitrocelulosa 6) Hibridización con sondas radiactivas 7) Autorradiografía

  13. Requerimiento de Ciclina E en Espermatogenesis • Se testearon 3 grupos: WT; E1 -/- y E2 -/- • E1 -/- • Nacieron de acuerdo con el ratio mendeliano y no se diferenciaron del WT • Histopatologicamente revelaron morfogénesis normal • Expectativa de vida normal • Apariencia Normal en toda su vida

  14. Requerimiento de Ciclina E en Espermatogenesis • Se testearon 3 grupos: WT; E1 -/- y E2 -/- • E2 -/- • Nacieron de acuerdo con el ratio mendeliano • Inicialmente no se diferenciaron del WT • Presentaron un 50% estériles, reducido tamaño testicular y menor cantidad de esperma • Paredes de los tubos seminíferos mas gruesos y menos células espermatogénicas • Meiosis anormal frecuente dentro de los espermatocitos y presencia de células multinucleares dentro del epitelio seminífero

  15. Requerimiento de Ciclina E en Espermatogenesis • Observación • Ciclina E2 es requerida para el normal desarrollo de células germinativas en machos y jugaría un rol importante en la meiosis • Las hembras deficientes de ciclina E2 se desarrollaron normal y eran totalmente fértiles • Además el desarrollo y su expectativa de vida fueron normales

  16. Requerimiento de Ciclina E en Espermatogenesis • Cruzamiento entre E1 y E2 y se generaron ratones que expresaban un solo alelo • Ciclina E1 -/- E2 +/- y Ciclina E1 +/- E2 -/- • Los primeros fueron iguales al control • Los segundos presentaron hipoplasia testicular e infertilidad que fue más pronunciada que cuando solo eran deficientes de E2

  17. Requerimiento de Ciclina E en Espermatogenesis • Estos análisis fenotípicos sugieren: • Las ciclinas E interactúan en sus funciones del ciclo celular • Que la expresión de un alelo es suficiente para el normal desarrollo • Otra explicación sería que la proliferación de ciertos tejidos no requieren ciclinas E

  18. Anormalidades Testiculares en ratones Ciclina E- (A) Cortes Histologicos teñidos con hematoxylina y eosina

  19. Requerimiento de Ciclina E en la Endoreplicación de Trofoblastos • Se cruzaron E1- y E2- • Ningún doble mutante nació vivo • Se recogieron embriones en distintos estados de desarrollo: • Día 10,25 : Cantidad de embriones vivos según lo esperado • Día 10,75 : 50% de los embriones estaban vivos y tenían un desarrollo retardado comparado con el WT • Día 11,5 : no se encontraron embriones vivos

  20. Requerimiento de Ciclina E en la Endoreplicación de Trofoblastos • Estudios histopatológicos determinaron que a pesar del crecimiento retardado, estos embriones desarrollaron una morfogénesis normal y sin señales de lesiones patológicas • En contraste, tejidos extraembrionarios revelaron anormalidades en las placentas • Los trofoblastos muy prominentes en la placenta de WT, estaban casi desaparecidos en los mutantes

  21. Requerimiento de Ciclina E en la Endoreplicación de Trofoblastos • Se observaron pequeños trofoblastos con núcleos mas pequeños • En WT usualmente los trofoblastos contienen hasta 1000N, en los mutantes se observaron alrededor de 100N, esto sugiere que la Ciclina E actúa en la endoreplicación • Dada la función central de los trofoblastos en la placenta, nuestra hipótesis que esto causaría la letalidad en los embriones

  22. Fenotipo de los embriones de la Ciclina E1−/−E2−/− (A) Supervivencia de embriones E1−/−E2−/− (B)Embriones WT y E1−/−E2−/− en el día 10.75de gestación (C) Cortes histológicos de placentas de WT y E1−/−E2−/− en el día10.5 de gestación. En las flechas se ven los nucleos de trofoblastos (D) Distribución ploide en trofoblastos

  23. Requerimiento de Ciclina E en la Endoreplicación de Megacariocitos Megacariocito • localizada médula ósea • productora de plaquetas • núcleo lobulado y poliploide  ENDORREPLICACIÓN Las células gigantes del trofoblasto necesitan ciclina E para sus rondas de replicación del DNA. ¿Qué pasa con los megacariocitos?

  24. Cultivo 72hs con trombopoyetina (estimulador de la endorreplicación) Inmunofluorescencia anti CD41-FITC (marcador de plaquetas y megacariocitos) Tinción del DNA con ioduro de propidio (agente intercalante fluorescente) Determinación de contenido de DNA en megacariocitos por citometría de flujo Requerimiento de Ciclina E en la Endoreplicación de Megacariocitos Embriones WT ó E1-/- E2-/- Aislamiento de megacariocitos de hígado

  25. WT contenido poliploide pico 32 N E1-/-E2-/- contenido poliploide pico 8 N CD41-FITC Fluo VERDE ioduro de propidio Fluo ROJA Se encuentra afectada la endorreplicación: este resultado junto con el dato obtenido en células gigantes del trofoblasto revela que la ciclina E es necesaria para el proceso de endorreplicación. Requerimiento de Ciclina E en la Endoreplicación de Megacariocitos Población CD41+ : megacariocitos

  26. Cultivo 72hs en DMEM 10% FBS Pulso de BrdU 1h Inmunofluorescencia con anti BrdU-FITC Tinción del DNA con ioduro de propidio Análisis de proliferación por citometría de flujo Ciclo Celular Contínuo en Ausencia de Ciclinas E en Fibroblastos Embrionarios Murinos (MEFs) Embriones WT ó E1-/- E2-/- Aislamiento de MEFs

  27. BrdU-FITC Fluo VERDE ioduro de propidio Fluo ROJA Pasajes tempranos de ambas líneas están en activa proliferación in vitro con más células células en G1 y menos en S en las mutantes respecto de las wild type Ciclo Celular Contínuo en Ausencia de Ciclinas E en Fibroblastos Embrionarios Murinos (MEFs) WT G1 55.3% S 28.9% G2/M 15.8% E1-/-E2-/- G1 68.0% S 18.2% G2/M 13.8%

  28. Embriones WT ó E1-/- E2-/- Aislamiento de MEFs Cultivo 7 días en DMEM 10% FBS Recuento celular día por día Al día 7 el incremento en MEFs mutantes es un 70% del incremento en WT: la proliferación en células mutantes está poco afectada en comparación con las WT Ciclo Celular Contínuo en Ausencia de Ciclinas E en Fibroblastos Embrionarios Murinos (MEFs)

  29. Western blot de embriones y MEFs 1) SDS-PAGE de extractos celulares 2) Transferencia a nitrocelulosa 3) 1° Anticuerpo: anti pRB anti ciclina A anti p27 4) 2° Anticuerpo: conjugado con peroxidasa 5) Detección de bandas por quimioluminiscencia Kinasa A: inmunoprecipitación y fosforilación de H1 con g-[32P]-ATP Tanto en embriones como en MEFs se encontraron rdos similares para mutantes y WT: las ciclinas E no se requieren para mantener un ciclo celular contínuo. Ciclo Celular Contínuo en Ausencia de Ciclinas E en Fibroblastos Embrionarios Murinos (MEFs) • Si se postuló que las ciclinas E: • Fosforilan RB • Inducen a la ciclina A • Degradan a p27 ¿Por qué su ausencia no arresta el ciclo celular?

  30. Objetivo: Requerimiento de Ciclina Epara reentrar al Ciclo Celular Analizar si las células E1-/-E2-/-, pueden reentrar al ciclo celular desde la fase G0. • Tomaron células E1-/-E2-/- y WT y las estimularon para reentrar a la fase S. • Las células fueron aquietadas por inhibición de contacto y estimuladas para entrar a la fase S en condiciones de baja densidad. Resultados: • Las WT entran a la fase S sincronizadamente a las 12 horas • Las células E1-/-E2-/-, nunca entran a fase S.

  31. Fosforilación de pRB?? • Compararon la fosforilación de la pRB a las 0 h. y a las 18 h. • WT hiperfosforilación • Seguimiento de la fosforilación a lo largo de las 18 h. • Determinaron la presencia de CDKE y CDKA con histona H1 como sustrato. Conclusión: en las célulasE1-/-E2-/- la CdKA es la causante de la fosforilación de la pRB, aunque esta se retrasa de 2-3 h.

  32. Fosforilación e inactivación de la pRB liberación de E2F • Estos factores son normalmente inducidos en E1-/-E2-/- ?? • CDC45 y CDC6: se expresaron normalmente tanto en células WT como en E1-/-E2-/-

  33. No se acoplan las MCM?? Examinaron la presencia de MCM2 en las células WT y las E1-/-E2-/-. • WT: MCM2 no estuvo unida al DNA ni en G0 ni en G1 temprana, pero a las 12 h. de la estimulación se asocia a la cromatina. Aparición de la CDKE. • E1-/-E2-/-: Nunca unieron las MCM2 al DNA. Los niveles libres de MCM2 fueron normales en ambos casos.

  34. Otros Complejos Pre-replicativos?? WT: • Proteína ORC2 permanece asociada al DNA. • CDC6 activada y unida al DNA a las 12 h. E1-/-E2-/-: • ORC2 fue asociado al DNA. • CDC6 fue unido al DNA casi al mismo tiempo que en las WT.

  35. Conclusión En ausencia de Ciclina E las células fallan en el ensamblaje normal de los complejos pre-replicativos, explicando su inhabilidad para entrar en el ciclo celular pero no en la continuidad del mismo.

  36. Resistencia a la transformación oncogénica de las células deficientes en ciclina E -Infectaron: WT y E1-/E2-fibroblastos con retrovirus codificando: • • H-ras + c-Myc • • H-ras + DN p 53 • • H-ras + E1A • • c-Myc • E1-/E2- no formaron • focos de células.

  37. G0 M G2 G1 S Ciclina E Punto de restricción

  38. Ciclina E. Acciones postuladas ● Activa E2F. ●Une y activa CDC25. ●Contribuye a la inactivación de RB. ●Desencadena la iniciación de la replicación del DNA (fase S). ●Control del centrosoma. ●Control de la biosíntesis de histonas vía fosforilación del p220.

  39. Ciclina D CDK 4,6 S Proteina del retinoblastoma Rb Rb Ciclina A Ciclina E CDK 2 CDK 2 Factor de transcrIpción E2F E2F DNA DNA P P P P CDK 1 Ciclina A, B G2 CDK 1 Ciclina B M G1 CDC25 Se favorece la transcripción de genes que permiten superar el punto de restricción en el ciclo celular.

  40. Ciclina E. Resultados ●Es prescindible para la embriogénesis normal del ratón. ●Es importante para el desarrollo de Drosophila melanogaster y Caenorhabditis elegans.

  41. Ciclina E. Resultados ●Efecto paradojal en la embriogénesis normal del ratón. ●Es esencial para el desarrollo normal de placenta de mamíferos. ● No es requerida para el desarrollo del embrión con excepción del sistema cardiovascular (requerimiento diferencial).

  42. Análisis ``in vitro´´ de células deficientes en ciclina E ● No es esencial para el ciclo celular continuo. ●Experimentos con la espermatogénesis. ●Durante el ciclo celular continuo, hay niveles normales de MCM (factor de inicio de la replicación) pero falla en su unión al origen de replicación, sin embargo esta función es favorecida por otras proteínas.

  43. Análisis ``in vitro´´ de células deficientes en ciclina E ● Es importante para la reentrada al ciclo desde la quiescencia (G0) y en las células con endoreplicación. ● Endoreplicación (síntesis de DNA sin mitosis) Experimentos con las células del trofoblasto y megacariocitos. ●La falla de la unión de MCM al origen de replicación, no es cumplida por otras proteínas.

  44. Análisis ``in vitro´´ de células deficientes en ciclina E ● Son resistentes a la transformación por varios pares de oncogenes. ●Los niveles de P21 son normales. Estos son (-) de CDK es decir (-) la fase S. ●Hay un umbral de la actividad de CDK que es requerida para la transformación oncogénica. ●Este umbral se puede alterar por:  CDK (de P21) o eliminar los activadores de las quinasa (ciclinas).

  45. Proteina del retinoblastoma no fosforilada Ciclina D Ciclina E Rb CDK 4,6 CDK 2 + + Factor de transcripción E2F DNA p21 p57 p27 G1 temprana Inhibidores de fase S G1 tardía Mecanismo de degradación de p27

  46. Recomendación Si una clase le produce dolores de cabeza SONRIA SIEMPRE

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