Εργαστηριακή διερεύνηση αυτοάνοσων νοσημάτων Αρχές μεθόδων-Εφαρμογές

1. Κατερίνα Αναστασίου -Γιώργος Παπαδόπουλος Ειδικευόμενοι βιοπαθολoγίας Γ.Ν.Θ. «Άγιος Παύλος» Συντονίστρια: Αναστασία Βακαλούδη Εργαστηριακή διερεύνηση αυτοάνοσων νοσημάτωνΑρχές μεθόδων-Εφαρμογές

2. Βασική αρχή ανοσολογικών αντιδράσεων Σύνδεση αντιγόνου-αντισώματος Διάγνωση ευρέως φάσματος νοσημάτων: Λοιμωδών Αιμολυτικών Αυτοάνοσων Νεοπλασματικών Ανοσοανεπαρκειών Διαπίστωση ιστοσυμβατότητας κ.τ.λ. Ορατή Μη ορατή

3. Ανοσολογικές μέθοδοιΠεριεχόμενα • Κύριες μέθοδοι στην εργαστηριακή διερεύνηση των αυτοάνοσων νοσημάτων • Aνοσοδιάχυση • Συγκόλληση • Ηλεκτροφόρηση • Θολωσιμετρία • Νεφελομετρία • Χρωματογραφία • Δεσμευτικές ανοσομέθοδοι -Ραδιοϊσοτοπικές μέθοδοι (RIA-ΙRMA) -Ανοσοενζυμικές μέθοδοι (EIA-ELISA) -Χημειοφωταύγεια (CHIA) -Ανοσοφθορισμός (ΙFA) • Μέθοδοι προσδιορισμού HLA • Κυτταρομετρία ροής

4. Μέθοδοι ανοσοδιάχυσης • Αρχή μεθόδου • Σχέση συγκέντρωσης Ag και Abμε το σχηματισθέν ίζημα Ag+Ab Ημίρρευστο υλικό ↑Ab ↑ Ag Γραμμή καθίζησης Χρωστική Σχηματισθέν ίζημα Πιο εμφανής γραμμή καθίζησης Ποσοτικές-Ποιοτικές Συγκέντρωση Ag

5. Μέθοδοι ανοσοδιάχυσης • Ποσοτικές • Ποιοτικές • Διπλή ανοσοδιάχυση • (πηκτή) • Κυκλοτερής ανοσοδιάχυση • (πηκτή) • Μονή ανοσοδιάχυση • (υγρό μέσο ή πηκτή) • Ηλετροανο-σομέτρηση • (πηκτή)

6. Ποιοτικές Μέθοδοι ανοσοδιάχυσης • Διπλή διάχυση προς δύο κατευθύνσεις (Ouchterlony) Γραμμή καθίζησης Άγαρ Διάλυμα αντισώματος Διάλυμα αντιγόνου

7. Ποσοτικές Μέθοδοι ανοσοδιάχυσης • Κυκλοτερής ανοσοδιάχυση (Mancini) Εξεταζόμενος ορός Άγαρ με ενσωματωμένο αντι-IgG,A,M αντίσωμα (αντιορό) (1,2,3,4) ορός γνωστής συγκέντρωσης IgG,A,M Διάμετρος δακτυλίου Συγκέντρωση αντιγόνου (IgG,A,M) Κυκλοτερής ανοσοδιάχυση σε πλάκα

8. Μέθοδοι ανοσοδιάχυσηςΕφαρμογές Προσδιορισμός: • CRP • Ανοσοσφαιρινών • αντι-ΕΝΑ • Παραγόντων του συμπληρώματος • Διάφορων πρωτεϊνών πλάσματος διαγνωστικής σημασίας κ.α.

9. Μέθοδοι συγκόλλησης Σωματιδιακό αντιγόνο + ομόλογο αντίσωμα → κροκίδες (συγκόλληση) • Άμεσες • Έμμεσεςή παθητικές Προσροφημένο αντιγόνο Φυσικό επιφανειακό αντιγόνο Κύτταρο ή Σωματίδιο Latex Κύτταρο • Εφαρμογές: • Ερυθρά αιμοσφαίρια → Παθητική αιμοσυγκόλληση • Σωματίδια Latex → Συγκόλληση Latex

10. Ερμηνεία συγκολλητινοαντίδρασης • Σχηματισμός δικτυωτού πλέγματος Αντιγονικές καθοριστικές ομάδες Fcτμήμα Ab Fabτμήμα Ab Fcτμήμα Ab Fabτμήμα Ab Προϋποθέσεις: Ικανή ισχύ Ab, σωστή αναλογία Ag/Ab, παρουσία ηλεκτρολύτη, κατάλληλη θερμοκρασία.

11. Μέθοδοι συγκόλλησης • Έμμεση αιμοσυγκόλληση Ερυθρά με προσροφημένο Ag + Αb Συγκόλληση ερυθρών Rose-Waaler test

12. Μέθοδοι συγκόλλησης • Συγκόλληση Latex • Μέθοδος έμμεσης (παθητικής) συγκόλλησης • Σωματίδιο Latex: Σωματίδιο πολυστυρενίου πάνω στο οποίο έχουν προσροφηθεί μόρια αντιγόνου • Σχηματική απεικόνιση συγκόλλησης Latex Σωματίδια Latex Ag Latex με αντιγόνο Latex με αντιγόνο Συγκόλληση Latex Αb

13. Μέθοδοι συγκόλλησης • Άμεση Coombs Ερυθρά με προσκολλημένα IgGαντισώματα Αντι-IgG (αντι- ανθρώπινη γ-σφαιρίνη) Συγκόλληση

14. Μέθοδοι συγκόλλησης • Έμμεση Coombs 1ο Στάδιο 2ο Στάδιο + + Φυσιολογικά ερυθρά Ορός αίματος με IgGAb Προσκόλληση IgGστα ερυθρά Αντι-IgG (αντι-ανθρώπινη γ-σφαιρίνη) Συγκόλληση

15. Μέθοδοι συγκόλλησηςΠλεονεκτήματα-Μειονεκτήματα-Εφαρμογές • Πλεονεκτήματα Απλότητα, ευκολία, ταχύτητα, μικρό κόστος, μεγάλη ευαισθησία και ποικιλία αντισωμάτων προς ανίχνευση. • Μειονεκτήματα Μη ειδικές συγκολλήσεις, δυσκολίες στην ανεύρεση και συντήρηση ερυθρών αιμοσφαιρίων, φαινόμενο προζώνης. • Γίνονται σε πλάκα ή δοκιμαστικά σωληνάρια και είναι ποιοτικές ή ημιποσοτικές (τίτλος Ab). • Εφαρμογές • Ποιοτικό και ημιποσοτικό προσδιορισμό CRP, RF, anti-DNA , αντισώματα κατά φωσφολιπιδίων (αLP) κ.α. • Διάγνωση της αυτοάνοσης αιμολυτικής αναιμίας.

16. Μέθοδοι ηλεκτροφόρησης • Φυσικοχημική μέθοδος διαχωρισμού πρωτεϊνών • Αρχή μεθόδου • Διαχωρισμός πρωτεϊνών με βάση τη διαφορετική (λόγω ΜΒ και φορτίου) κινητικότητα των μορίων εντός κατάλληλου υλικού, κατά την εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου • Υπεργαμμασφαιριναιμία • Οξείες, χρόνιες λοιμώξεις • Χρόνιες φλεγμονώδης παθήσεις • Νεοπλάσματα • Αυτοάνοσα νοσήματα

17. Μέθοδοι ηλεκτροφόρησης • Ηλεκτροφόρηση ζώνης • Ηλεκτροφόρηση εντός αγαρόζης ή οξικής κυτταρίνης • PAGE (polycrilamide gel electroforesis) • Ηλεκτροφόρηση σε gel πολυακρυλαμιδίου (μοριακό διαχωριστικό μέσο) → αύξηση διαχωριστικής ικανότητας

18. Μέθοδοι ηλεκτροφόρησης • SDS (sulfododegylic sodium) • ΔωδεκυλικόNa→ εκδίπλωση πρωτεϊνών, σταθερή αναλογία φορτίου/μάζας→ κίνηση μορίων αντιστρόφως ανάλογη του ΜΒ • SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση • Συνδυασμός SDS και PAGE ηλεκτροφόρησης

19. Μέθοδοι ηλεκτροφόρησηςΑνοσοηλεκτροφόρηση • Αρχή μεθόδου Ορός Αγαρόζη Ηλεκτροφόρηση Διαχωρισμός πρωτεϊνών ορού Διαδρομή ορού Αυλάκι Αντίσωμα (Αντιορός) Επώαση Ηλεκτροφόρηση + Διπλή ανοσοδιάχυση Διάχυση αντοορού Διάχυση πρωτεΐνης Τόξο καθίζησης

20. Μέθοδοι ηλεκτροφόρησηςΑνοσοηλεκτροφόρηση • Ανοσοηλεκτροφορήματα Τόξο καθίζησης φυσιολογικής πρωτεΐνης Τόξο καθίζησης μονοκλωνικής πρωτεΐνης (ανώμαλη πάχυνση ή κύρτωση) Ανίχνευση μονοκλωνικής πρωτεΐνης

21. Μέθοδοι ηλεκτροφόρησηςΑνοσοκαθήλωση • Αρχή μεθόδου Ηλεκτροφόρηση του προς μελέτη ορού Ανοσοκαθήλωση φυσιολογικού ορού Επίστρωση αντιορού σ’ όλη την επιφάνεια ηλεκτροφόρησης Επώαση Χρωστική Ανίχνευση μονοκλωνικής πρωτεΐνης Δημιουργία ζώνης καθίζησης

22. Μέθοδοι ηλεκτροφόρησηςΑνοσοκαθήλωση • Εφαρμογές • Κρυοσφαιρίνες • ds DNA • Μονοκλωνικέςανοσοσφαιρίνες (ΡΑ, ΣΕΛ, σύνδρομο Sjögren) κ.α Ανίχνευση μονοκλωνικής πρωτεΐνης

23. Μέθοδοι ηλεκτροφόρησης • Μιας διάστασης διπλή ηλεκτροανοσοδιάχυση (counter ηλεκτροφόρηση) • Μιας διάστασης μονή ηλεκτροανοσοδιάχυση (rocket ηλεκτροφόρηση,τεχνική Laurell) • Ανοσοαποτύπωση (Western blotting)

24. Μέθοδοι ηλεκτροφόρησηςΑνοσοαποτύπωση (Western blot) • Αρχή μεθόδου Ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός βάσει ΜΒ σε πήκτωμαπολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση) • Μεταφορά σε ΝΚ με εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου • Επώαση με Αb • Επώαση με αντι-Αbιχνηθετημένο • Ακολουθεί ανίχνευση • Ενζυμοανοσολογικά • Ραδιοϊσοτοπικά • Με χημειοφωταύγεια

25. Μέθοδοι ηλεκτροφόρησηςΑνοσοαποτύπωση (Western blot) • Εφαρμογές • ENA (Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl70, Jo1,CENP κ.α.), dsDNA, AMA, αντι- CCP, κ.α. • Ιστόνες (Η1, Η2Α, Η2Β, Η3, Η4) κ.α. • Προσδιορισμός κρυοσφαιρινών • Πολυπεπτίδια σύνθετων Ag (Β΄,Β, D τουSm), (70kD, A, C του RNP) • Πολλά ταυτόχρονα Aabsκαι πολυπεπτίδια κ.α

26. Θολωσιμετρία • Μέτρηση της απορρόφησης της ακτινοβολίας, που προκύπτει όταν δέσμη φωτός προσπίπτει σε σωματίδια μεγάλης διαμέτρου (συμπλέγματα μορίων με σωματίδια Latex, ανοσοσυμπλέγματα)

27. Νεφελομετρία • Μέτρηση της έντασης της σκέδασης, που προκύπτει όταν δέσμη φωτός προσπίπτει σε σωματίδια μεγάλης διαμέτρου (συμπλέγματα μορίων με σωματίδια Latex, ανοσοσυμπλέγματα)

28. Νεφελομετρία • Πλεονεκτήματα-Μειονεκτήματα • Ακριβής,ταχεία, εύκολη • Καλή ευαισθησία και ειδικότητα • Δυνατότητα μέτρησης χαμηλών συγκεντρώσεων (10ˉ³ - 10ˉ⁶g/L) • Αυτοματοποιημένη • Σφάλματα μετρήσεων (λιπαιμικός ορός, σκόνη, συγκρίματα πρωτεΐνών). • Εφαρμογές • ΑνοσοσφαιρίνεςIgG,IgM, IgA, IgE • Υποτάξεις ανοσοσφαιρινών • κ και λ αλυσίδες • C3, C4, CRP, RF • β2 μικροσφαιρίνη Ένταση σκεδ/νου φωτός Συγκέντρωση πρωτεϊνών

29. Χρωματογραφία • Ομάδα μεθόδων για το διαχωρισμό των συστατικών ενός μίγματος, που μοιάζουν μεταξύ τους ως προς τις φυσικές και χημικές ιδιότητες, π.χ. πρωτεΐνες, αμινοξέα, σάκχαρα, βιταμίνες, φάρμακα. • Μίγματα όπως • Βιολογικά υγρά • Πλάσμα • Ούρα • Εκχύλισμα ιστών

30. Χρωματογραφία • Αρχή μεθόδου • Είναι σύστημα ΔΥΟ ΦΑΣΕΩΝ: σταθερής και κινητής. • Το δείγμα διοχετεύεται στην κινητή φάση ή εφαρμόζεται στη σταθερή • Η κινητή φάση ρέει κατά μήκος της σταθερής και παρασύρει το δείγμα • Ο διαχωρισμός των συστατικών του δείγματος στηρίζεται στο διαφορετικό βαθμό αντίδρασής τους με καθεμιά από τις φάσεις.

31. Χρωματογραφία • Χρωματογραφικές μέθοδοι • Πηκτής • Ανταλλαγής ιόντων • Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) • Συγγενείας • Εφαρμογές • CRP • ENA • Ανοσοσυμπλέγματα κ.α. HPLC

32. Δεσμευτικές ανοσομέθοδοι • Μέθοδοι ΙΑ • RIA-IRMA • ΕΙΑ (ELISA) (10ˉ⁹ - 10ˉ¹² g/L) • CHIA-ΙCHIA • IFA Ανταγωνιστικές Μη ανταγωνιστικές Ποιοτικές-Ποσοτικές • Αρχή μεθόδου

33. Ανταγωνιστικές ανοσομέθοδοι (Competitive immunoassay) • Αρχή μεθόδου Ανοσολογικές μέθοδοι όπου η ένταση του αποτελέσματος είναι αντιστρόφως ανάλογη της συγκέντρωσης της προσδιοριζόμενης ουσίας • Σχηματική απεικόνιση ανταγωνιστικής μεθόδου

34. Μη ανταγωνιστικές ανοσομέθοδοι (Ιmmunometric assay) • Αρχή μεθόδου Ανοσολογικές μέθοδοι όπου η ένταση του αποτελέσματος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της προσδιοριζόμενης ουσίας • Σχηματική απεικόνιση μη ανταγωνιστικής μεθόδου

35. Ραδιοϊσοτοπικές μέθοδοι Radio-Immuno-Assay (RIA) • Αρχή μεθόδου Ανταγωνιστική τεχνική στην οποία χρησιμοποιούμε ραδιενεργά σημασμένοAg το οποίο ανταγωνίζεται με το προς μέτρηση Ag για την πρόσδεση σε περιορισμένη ποσότητα του αντίστοιχου Ab

36. Ραδιοϊσοτοπικές μέθοδοι Immuno-Radio-Metric-Assay (IRMA) • Αρχή μεθόδου • H προς μέτρηση ουσία δεσμεύεται από δύο Ab, ένα ραδιενεργό και ένα μη ραδιενεργό • Περισσότερο ευαίσθητη • Σχηματική απεικόνιση ΙRMA

37. Ραδιοϊσοτοπικές μέθοδοιΕφαρμογές • Εφαρμογές • CRP, RF • Συμπλήρωμα • dsDNA, AMA, Αbsκατά φωσφολιπιδίων (aLP) κ.α. • Αντιθυρεοσφαιρινικά αντισώματα (anti-TG). • Αντισώματα έναντι της θυρεοειδικήςυπεροξειδάσης (anti-TPO). • Αντιμικροσωμιακάθυροειδούς (anti-M).

38. Ανοσοενζυμικές μέθοδοι (ΕΙΑ)Enzyme-Links-Immuno-Sorment-assay (ELISA) • Αρχή μεθόδου Ανίχνευση της προσδιοριζόμενης ουσίας με τη χρήση δεύτερης, ομοιοπολικά συνδεδεμένης με ένζυμο, που έχει σχέση Ag/Ab Χρωμογόνο υπόστρωμα (άχρωμο) Ένζυμο Προϊόν έγχρωμο Φωτόμετρο Οπτική πυκνότητα έγχρωμου προϊόντος Βαθμονομημένη καμπύλη Συγκέντρωση προσδιοριζόμενης ουσίας

39. Ανοσοενζυμικές μέθοδοι (ΕΙΑ) ELISA • Ανταγωνιστική ΕLISA • Η τελική χρωματική ένταση αντιστρόφως ανάλογη της συγκέντρωσης της προσδιοριζόμενης ουσίας • Μέθοδος εκλογής για μικρού ΜΒ ουσίες • Σχηματική απεικόνιση ανταγωνιστικής ELISA

40. Ανοσοενζυμικές μέθοδοι ELISA • Μη ανταγωνιστική (μέθοδος Sandwich) Η τελική χρωματική ένταση ανάλογη της συγκέντρωσης της προσδιοριζόμενης ουσίας • Μέθοδος εκλογής για ειδικά Ab, αυτοαντισώματα, κυτταροκίνες, ελεύθερ0υς υποδοχείς κ.α. • Πιο ευαίσθητη, λιγότερο ειδική από την ανταγωνιστική • Σχηματική απεικόνιση μη ανταγωνιστικής ELISA

41. Εφαρμογές ΕLISA • Αυτοαντισώματα • ΑΝΑ • anti-DNA • Anti-ENA • AMA • ASMA • p-ANCA, c-ANCA • anti-GB • anti-TG, anti-TPO • RF • Αντι-CCP • Καρδιολιπίνης, φωσφολιπιδίων κ.α. • Κυτταροκίνες και διαλυτοί υποδοχείς κυτταροκινών • Παράγοντες συμπληρώματος • Ειδικά Ab, τάξης ΙgE, (μέθοδος RAST) • Μόρια προσκόλλησης, αυξητικοί παράγοντες, προσταγλανδίνες, λευκοτριένια, κυτταροτοξικά αντισώματα κ.α.

42. ELISA vs RIA USERIA(x1000 ευαισθησία)

43. Χημειοφωταυγιομετρικές μέθοδοι Chemiluminescence-Immuno-Assay (CHIA) • Αρχή μεθόδου Αντί χρωμογόνων και, φθοριζόντων υποστρωμάτων χρησιμοποιούνται υποστρώματα τα οποία φωταυγάζουν, δηλαδή έχουν την ιδιότητα να μετατρέπουν μέρος της ενέργειας, από μία μεσολαβούσα χημική αντίδραση, σε φωτεινή ακτινοβολία • Αλκαλική φωσφατάση • Αποφοσφορυλίωση υποστρώματος → ασταθές προϊόν που φωταυγάζει

44. Εφαρμογές Χημειοφωταύγειας • Αντισώματα έναντι εκχυλίσματος πυρηνικών αντιγόνων (anti-ENA). • Αντισώματα έναντι της διπλής έλικας DNA (anti-dsDNA). • Αντικαρδιολιπινικά αντισώματα (αCL-IgG, IgM). • Αντι-β2 γλυκοπρωτ/εϊνικάαντισ/τα (αβ2GPI-IgM, IgG). • Αντιγλοιαδινικά αντισώματα (DGP-IgG, IgA). • Αντισώματα τρανσγλουταμινάσης (anti-tTG-IgA). • Αντιθυρεοσφαιρινικά αντισώματα (anti-TG). • Αντισώματα έναντι της θυρεοειδικήςυπεροξειδάσης(anti-TPO) κ.α.

45. CHIAVS ELISA - RIA • Μεγάλη ευαισθησία • Μικρό όγκο δείγματος • Μικρό χρόνο επώασης • Σταθερά αντιδραστήρια • Πλήρως αυτοματοποιημένη μέθοδος • Μετράει φως και ευκολότερα δέχεται παρεμβολές από την ποιότητα του αίματος που αναλύεται (αιμολυμένος ή λιπαιμικός ορός).

46. ΑνοσοφθορισμόςImmuno-Fluorescence-Assay (IFA) • Αρχή μεθόδου Ανοσοϊστοχημική τεχνική κατά την οποία το ειδικό σύμπλεγμα Ag-Ab γίνεται ορατό με τη βοήθεια Abσημασμένου με φθοριόχρωμαστο μικροσκόπιο φθορισμού

47. ΑνοσοφθορισμόςImmuno-Fluorescence-Assay (IFA) • Φθορίζον αντίσωμα Αντιορός έναντι της ανθρωπείου γ-σφαιρίνης ή μεμονωμένων τάξεων ανοσοσφαιρινών, σημασμένων με φθορίζουσα χρωστική

48. ΑνοσοφθορισμόςImmuno-Fluorescence-Assay (IFA) • Αρχή παραγωγής φθοριοχρώματος • Φθορισμός Εκπομπή φωτός μεγαλύτερου μήκους κύματος από μια ουσία όταν αυτή ακτινοβοληθεί με φως μικρότερου μήκους κύματος. • Φθοριοχρώματα • Ισοθειακυανικήφλουορεσκίνη (FITC)-πράσινη • Ισοθειοκυανικήτετραμεθυλροδαμίνη (TMRITC)-κόκκινο • Φυκοερυθρίνη (PE)-πορτοκαλί

49. ΑνοσοφθορισμόςImmuno-Fluorescence-Assay (IFA) • Μικροσκόπιο με προσπίπτοντα φωτισμό Προσοφθάλμιος Ηθμός φραγμού Δίκοιλοκάτοπτρο αντικειμενικός Διεγερτικός ηθμός παρασκεύασμα

50. ΑνοσοφθορισμόςImmuno-Fluorescence-Assay (IFA) • Μικροσκόπιο με διερχόμενο φωτισμό Προσοφθάλμιος φακός αντικειμενικός Ηθμός φραγμού πυκνωτής παρασκεύασμα Διεγερτικός ηθμός