460 likes | 565 Views
A membrántranszport molekuláris mechanizmusai. A membrántranszport alapjai 3. Felhasználtam Dr. Czirják Gábor ábraanyagát. A membrántranszport alapjai Membránpotenciál - bevezetés. +. Általában a sejtek belső tere negatívabb az extracelluláris térnél nyugalmi körülmények között. V.
E N D
A membrántranszport molekuláris mechanizmusai A membrántranszport alapjai 3. Felhasználtam Dr. Czirják Gábor ábraanyagát
A membrántranszport alapjai Membránpotenciál - bevezetés + Általában a sejtek belső tere negatívabb az extracelluláris térnél nyugalmi körülmények között. V Extracelluláris Intracelluláris ( -70 mV) (0 mV)
A membrántranszport alapjai Potenciálkülönbség elektrolitokban - néhány elvi lehetőség + • Diffúziós potenciálEltérő ionmobilitású anion és kation esetén.(pl. egy csepp sósav diffúziója) V Cl- H+
ΔE 1, az oldat ionjait a koncentráció különbség mozgatja a túloldalra 2, a különbözőtöltésselrendelkezőionokátlépésisebessége a szemipermeábilishártyánkeresztülkülönböző– az ábrán az előre siető negatív töltésű ionok a túloldalon negatív töltésű réteget hoznak létre, így átmeneti feszültség: diffúziós potenciál alakul ki 3, ez lassítja a további anion előrehaladást de gyorsítja a kationok átjutását – ez a hatás csökkenti a diffúziós potenciált 4, a végén a koncentrációk kiegyenlítődnek, és a diffúziós potenciál eltűnik
Hány darab anion átlépése kell -100 mV feszültség kialakításához egy 1 μm2-es membránon? -100 mV Persze csak egy pillanatig, amíg a kation párja azonos irányban őt nem követi
A membrántranszport alapjai Potenciálkülönbség elektrolitokban - néhány elvi lehetőség + 2. MembránpotenciálElőfeltétel: egyenlőtlen ionmegoszlás és szelektív permeabilitás A. Egyensúlyi potenciál Szelektív permeabilitású membrán (átmegy: K+, nem: Cl-) V -60 mV • K+ áramlás a koncentráció- különbség miatt • A kialakuló feszültség leállítja a további áramlást (egyensúly) Cl- K+ K+ Cl- Cl- K+ 100 mM KCl 10 mM KCl
A membrántranszport alapjai Potenciálkülönbség elektrolitokban - néhány elvi lehetőség Az egyensúlyi potenciál jellemzői • Néhány ezer ion egyenlőtlen megoszlása elég a potenciálkülönbség kialakításához, az ionkoncentrációk változása elhanyagolható. • Az egyensúlyi potenciál tartósan (elvileg végtelen ideig) fennállhat. Ilyenkor a koncentrációkülönbség miatt az egyik irányba ugyanannyi ion mozog, mint a potenciálkülönbség miatt a másikba. • Minél nagyobb a membránon átjutó ion két oldalon található koncentrációinak hányadosa, annál nagyobb a potenciálkülönbség.
- RT zF - 60 mV cBELSŐ z cKÜLSŐ Az egyensúlyi potenciál kiszámítása • Nernst egyenlet:E =ln • E : membránpotenciál (volt) • R: általános gázállandó ( 8.31 J/mol/K) T: abszolút hőmérséklet (K) • z : töltésszám (K+-ra: pl. +1) F : Faraday-állandó ( 96500 C/mol) • Gyakorlatban jól használható formája:E=log10 cBELSŐ cKÜLSŐ
140 mM - 60 mV EK=log10 - 90 mV 4 mM +1 15 mM 4 mM - 60 mV - 60 mV - 60 mV ECl=log10 - 80 mV ENa=log10 + 60 mV 140 mM 103 mM +1 +2 -1 10-7 M ECa=log10 + 120 mV 10-3 M Az egyes ionok egyensúlyi potenciálja állati sejtekben fiziológiás ionmegoszlások esetén
A membrántranszport alapjai Potenciálkülönbség elektrolitokban - néhány elvi lehetőség • B,Donnan-potenciál • Ionokraátjárható, fehérjére nem permeábilis membrán esetén jön létre • A negatív töltésekkel rendelkező fehérjék oldalán nagyobb kation koncentráció és a kis molekulájú, permeábilis anion alacsonyabb koncentrációja alakul ki az ellenkező oldalhoz képest, egyensúlyi állapot formájában. -10 – -15 mV potenciálkülönbség jön létre. (A fehérjék oldala a negatívabb.) • A sejt nyugalmi membránpotenciálja döntően NEM a Donnan-potenciálon alapul.
A membrántranszport alapjai Potenciálkülönbség elektrolitokban - néhány elvi lehetőség • C. Pumpapotenciál • A H+-pumpa, és állati sejtek esetén a nátrium pumpa (Na+/K+-ATPáz) elektrogén. (3 Na+ ki, 2 K+ be) • A H+-pumpa (és Na+-pumpa) folyamatos működése ezért negatívabbá teszi a sejt belsejét. Ez közvetlenül csak kb. 10-20 mV-tal járul hozzá a membrán-potenciálhoz. • A Na+-pumpa azonban az egyenlőtlen külső és belső Na+és K+ koncentrációkat biztosítja, és így közvetve a membránpotenciál fenntartásához szükséges.
V -60 mV K+ egyensúlyi potenciál !! Vm = -60 mV IK=INa=0 + Cl- K+ K+ Cl- Cl- K+ A sejt membránpotenciálja – rávezető gondolatkísérlet I. PK>>PNa=0 PCl=0 “I” “E” Em = ? 10 mM NaCl 100 mM NaCl 100 mM KCl 10 mM KCl
V +60 mV Na+ egyensúlyi potenciál !! Vm = +60 mV IK=INa=0 + Na+ Cl- Cl- Na+ Na+ Cl- A sejt membránpotenciálja – rávezető gondolatkísérlet II. PNa>>PK=0 PCl=0 “I” “E” Em = ? 10 mM NaCl 100 mM NaCl 100 mM KCl 10 mM KCl
V 0 mV IK = -INa>0 Vm = 0 mV Koncentráció-kiegyenlítődés Na+ K+ A sejt membránpotenciálja – rávezető gondolatkísérlet III. PNa=PK>0 PCl=0 “I” “E” Em = ? 10 mM NaCl 100 mM NaCl 100 mM KCl 10 mM KCl
A III. gondolatkísérlet ‘tanulságai’ • A kifelé áramló pozitív töltések áramát tekintjük pozitívnak hagyomány szerint. (A példában IK>0) • Stabil membránpotenciál esetén a membránon átfolyó összes áram összege nulla. (A példában IK+INa=0) (Egyébként valamelyik oldalon töltésfelhalmozódás lenne, és Vm változna) • Ha membrán többféle ionra is permeábilis, akkor hosszú idő után a koncentrációk kiegyenlítődhetnek. • (A példában mindkét oldalon [Na+] = [K+] = 55 mM értéken). • In vivo ezt a Na+-pumpa akadályozza meg.
V IK = -INa>0, mert egyensúly van (állandó Vm) EK < Vm << 0 Koncentráció-kiegyenlítődés + Na+ K+ IV. Az állati sejtek nyugalmi membránpotenciálja PK>>PNa>0 PCl=0 “I” “E” Vm hol van az EK, 0, ENa értékekhez képest? 10 mM NaCl 100 mM NaCl 100 mM KCl 10 mM KCl
A IV. gondolatkísérlet ‘tanulságai’ Egy ‘átlagos’ nyugvó állati sejtben: - kifelé K+ áramot befolyásolja: nagy koncentrációkülönbség nagy K+ permeabilitás negatív membránpotenciál - befelé Na+ áramot befolyásolja:nagy koncentrációkülönbség kis Na+ permeabilitás negatív membránpotenciál Így a két áram egyenlő stabil nyugalmi Vm
A membrántranszport alapjai A membránpotenciál kiszámítása • Vm: EK és ENa között van. • Hogy hol, az a PK és PNa arányától függ. • PNa<PK (nyugalmi) esetben: EK<Vm<<ENa • PNa>PK esetben: EK<<Vm<ENa • Képlettel: Vm= EK+ ENa+… • (ahol g=1/R: vezetőképesség (Siemens)) PK[K+]I+PNa[Na+]I+PCl[Cl-]E PK[K+]E+PNa[Na+]E+PCl[Cl-]C gNa gteljes gK gteljes - RT zF • Vm kiszámítható (Goldman-Hodgkin-Katz, GHK) • Vm = ln
Mitől és milyen irányban változhat a membránpotenciál? • Vm : depolarizációVm : hiperpolarizáció • “pozitívabbá válik” “negatívabbá válik” • Ionkoncentráció változás (in vivo nem jellemző)pl.[K+]EIK, out depol. • [Na+]I INa, in hiperpol. • Permeabilitás változás (in vivo a szab. fő útja)pl. PK IK hiperpol.PNa INa depol.
A membrántranszport alapjai Szelektív permeabilitás - ioncsatornák Mi biztosítja a sejtmembrán szelektív permeabilitását? Ioncsatornák • Transzmembrán fehérjék, melyek hidrofil pórust képeznek ionok számára • Egy ion transzportja során nincs konformációváltozás, csak nyitás zárásnál • Igen magas katalitikus szám (106-108 ion/sec) • Erősen szelektívek lehetnek (1 hiba/103-104 ion) • Nyitás zárás szabályozott lehet, ez alapján csoportosíthatók: • - ligandfüggő - háttér (csurgó, leak) • - feszültségfüggő • - mechanoszenzitív
A membrántranszport alapjai Szelektív permeabilitás - ioncsatornák Ionszelektivitás szerinti felosztás anioncsatornák (Cl-,NO3-) kationcsatornák Szelektív (K+, Ca2+) nem specifikus csak egyértékű (monovalens) ionokat ereszt át (Na+és K+) kétértékű (bivalens) ionokat is átereszt (Na+, K+ ésCa2+)
A membrántranszport alapjai Kation csatornák pórus hurkokkal Egy pórus hurkokkal rendelkező K+-ioncsatorna háromdimenziós modellje oldal- és felülnézetben. A különféle ioncsatorna-féleségek alegységeinek síkban kiterített szerkezete. Pórus motívum A csatorna négy alegységből szerelődik össze. Amíg egyes K+-csatornák két, vagy négy alegységből szerelődnek össze, addig a Na+- és Ca2+-csatornákat egyetlen hosszú polipeptid lánc alkotja. K+ csatorna alegységek
K+ csatornák K+ csatornák Nátrium & Kalcium Feszültség-kapuzott KQT eag slo CNG Novel > 23 gén KVLQT KVLQT2 slo slo2/slack eag erg elk A Ca2+- és a Na+-csatornák génjei egy ősi K+-csatorna-gén ismételt duplikációja és módosulása nyomán képződtek. Az ioncsatornák génjei az evolúció során kialakult és bevált funkció megőrződéséről, variálódásáról szólnak.
Szűk nyaki rész: 1,2 nm hosszú, átmérője 0,28 nm. A csatorna átmérője szabja meg, hogy milyen ionok haladhatnak át rajta. A nyaki rész falát a pórusmotívum (signature sequence) aminosavjai burkolják. Mivel a K+-ionok hidrátburkát alkotó vízmolekulák 0,28 nm-re vannak a K+-ion középpontjától, a járat túl szűk egy K+-ion áthaladásához. A hidrátburok vízmolekuláit csak komoly energiabefektetés árán lehet eltávolítani, ám a K+-csatornák működésük során nem fogyasztanak energiát. Mégis, miként lehetséges az, hogy a nyitott K+-csatornán másodpercenként nagyjából egymillió K+-ion halad át? A szűk járat belső felszínén karbonil- (C=O) oxigén-atomok vannak. Az oxigénatomok részleges negatív töltést hordoznak, és úgy helyezkednek el, hogy a járaton áthaladó K+-ionok a hidrátburok vízmolekulái helyett az oxigénatomokkal lépjenek kölcsönhatásba. A kölcsönhatás energetikailag kedvező környezetet teremt az ionok áthaladásához.
A szelektivitási filter szerkezete: a VGYG motívum KcsA (2TM1P) csatornában A szelektivitási filter szerkezete (karbonil oxigének)
Roderick MacKinnon (47), laureate of the Nobel Prize in Chemistry 2003 K+ ionok (zöld) és víz molekulák (piros) áthaladása a póruson. „Billiárd-típusú” átjutás
A membrántranszport alapjai Kálium ionok átjutása Kv1.2 csatornán – számítógépes szimuláció
A membrántranszport alapjai A szelektivitási filter szerkezete (a K+ szelektivitás mechanizmusa) A K+-nál (1,33 Å) kisebb átmérőjű Na+-ionok (0,95 Å) számára a karboniloxigén-atomok (C=O) túlságosan távol helyezkednek el, amiért nem tudnak az ionnal kölcsönhatásba lépni, ami miatt a Na+-ionok nem tudnak átjutni a K+-csatornákon. Másképpen: a Na+-ionok erősebben kötik a vizet, mint a K+-ionok, nem képesek elegendően közel menni a szűrőhöz, hogy elveszítsék a hidrátburkot. Szelektivitás: 1:1000. Na+ K+
Kapuzás a “belső szájadékban” A kapuzó hélix (H5) helyzetét a sejtmembránban az határozza meg, hogy milyen kölcsönhatás van a membrán két oldalán felhalmozódott töltések és a kapuzó hélixek töltése között. Depolarizáció során a kapuzó hélix a sejthártya külseje felé mozdul, és miközben megváltozik az ioncsatorna szerkezete, kinyílik, rajta ionok áramlanak át. Állati sejtekben az átáramló ionáram erőssége már a depolarizáció alatt csökkenni kezd, mert a csatorna inaktiválódik.
A membrántranszport alapjai Az inaktiváció Állati sejtekben a feszültségfüggő Na+ csatorna inaktiválódik (akciós potenciál). Növényeknél nem jellemző a hasonló inaktiváció (pl. GORK 30 percig is aktív marad), az AP másként keletkezik. A csatornának 3 funkcionális állapota van: Zárt Depolarizáció Nyitott Spontán Repolarizáció Inaktív (nem vezet)
Az inaktiváció kísérletes kimutatása (makroszkópos áram) zárt nyitott inaktív Em INa Idő (ms)
A megnyílás és az inaktiváció is statisztikus jelenség az elemi áram szintjén Em elemi áramok több mérés során egy csatornán összegzett áram Idő (ms)
Inaktiváció“tömeszeléses” mechanizmussal: N-típusú inaktiváció Az N típusú inaktiváció esetében az ioncsatorna fehérje N-terminálisa a pórus citoplazma felőli bejáratához kötődik, bedugaszolja a csatornát
Kapuzás a szelektivitási filterben: C-típusú inaktiváció C típusú inaktivációt - nevével ellentétben - nem a fehérje C-terminálisa, hanem a szűk nyaki rész körüli fehérjerészek okozzák: az ioncsatorna a fényképezőgépek blendéjéhez hasonlatos módon záródik.
A szelektivitási szűrő K+-függő szerkezetváltozásának biológiai jelentősége. szelektivitási szűrő 2 1 aktivációs kapu A szűrő kálium-koncentrációtól függően zárt (low K+) és nyitott (high K+) állapotú lehet. Ha az aktivációs kapu nyílik (1), több kálium jut a szűrő közelébe, high K+ állapotú szűrő nyitódás (2). Zárt aktivációs kapu esetén a low K+ állapot alakul ki. Ez a magyarázata a milliszekundumos nagyságrendű „pislákoló” ioncsatorna nyitódásnak-záródásnak, mely még nyitott feszültség-függő aktivációs kapu esetén is mérhető.
A membrántranszport alapjai K-csatorna inaktiváció Nyugalmi helyzet, zárt csatorna Depolarizált sejthártya, nyitott helyzet Depolarizált sejthártya, N-típusú inaktiváció Depolarizált sejthártya, C-típusú inaktiváció
A sejt ionáramainak mérése: patch clamp Sejtre tapasztott (cell-attached) felállás Mekkora áramot kell átfolyatnom, hogy Vm az általam megkívánt érték legyen? Feszültség clamp Pipetta széle és a membrán között NAGY (G) ellenállású kapcsolat (seal). mért csatornák
A sejt ionáramainak mérése: patch clamp Teljes sejt (whole cell) felállás Feszültség clamp mért csatornák
A sejt ionáramainak mérése: patch clamp Kivágott folt (excised patch) felállás Feszültség clamp mért csatorna/csatornák (Akár egy csatorna árama is mérhető, az áram pA (10-12 A) nagyságrendű.) Nyitott Zárt
Az ioncsatornák működése: makroszkópos áram (sok ugyanolyan csatorna együttes árama) K+ szelektív pórus(PK konstans, nem függvénye Vm-nek), szimmetrikus oldatok I C2 Feszültség-áram összefüggés C1 < C2 C1 Vm (mV) Pl.: mindkét oldalon 4 mM [K+] mindkét oldalon 140 mM [K+]
K+ szelektív pórus, aszimmetrikus oldatok I C2 EK C1 Vm (mV) Pl.: belül C2=140, kívül C1=4 mM [K+] IK=0, ha Vm=EK
Feszültségfüggő, kifelé rektifikáló K+ csatorna (pl. GORK) PO nyitási valószínűség Vm (mV) I leak (csurgó) K+ áram (EK fölött IK>0) EK Vm (mV) I Feszültségfüggő csatorna K+ árama (EKés küszöb között IK=0) EK Vm (mV) küszöb -30 mV
Befelé rektifikáló K+ csatorna (pl. KAT1) PO nyitási valószínűség Vm (mV) I leak (csurgó) K+ áram EK Vm (mV) EK I (nagyítva!) bef. rekt. csatorna K+ árama (EKfelett: IK>0 csak egy szűk tartományban) Vm (mV)
Cl- szelektív pórus, aszimmetrikus oldatok I C1 C2 Vm (mV) ECl Pl.: belül C1=140, kívül C2=15 mM [Cl-] ICl=0, ha Vm=ECl
Feszültségfüggő Cl--csatorna nyitási valószínűség Vm (mV) I leak (csurgó) Cl- áram Vm (mV) ECl I Feszütségfüggő csatorna Cl- árama Vm (mV) küszöb -75 mV ECl ECl pozitív értékű, mert [Cl-]cyt > [Cl-]extracell
A membrántranszport alapjai 6. A növényi ioncsatornák működése PM, Anion csatornák Turgor beállításnál hipotóniás stressz esetén a sók kiáramlását szabályozza Legfőképp Cl- ionról van szó, ezek Ca2+-aktivált csatornák, 2 osztálya van: S(slow)-típusú és R(rapid)-típusú feszültségfüggő anion csatorna Szerkezetük: 13 TM szegmens S-típusú R-típusú ECl általában pozitív értéket ér el, mert [Cl-]cyt > [Cl-]extracell 3 db fontos funkció: A csatornák nyitódása nem csak Cl- vesztést eredményez, hanem membrán depolarizációt is okoz. Ez aktiválja a kifelé egyenirányító K+-csatornákat a sók kiáramlásánál. A jelátvitel során tapasztalható membrán-depolarizációban központi jelentőségű. Erős hiperpolarizáció esetén nyitódnak (ha a befelé egyenirányító K+-csatornák működése gátolt pl. kevés külső K+ cc. esetén)