metabolismo n.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
Metabolismo PowerPoint Presentation
Download Presentation
Metabolismo

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 112

Metabolismo - PowerPoint PPT Presentation


  • 686 Views
  • Uploaded on

Metabolismo. Il metabolismo di uno xenobiotico è l’insieme delle trasformazioni chimiche che la molecola subisce all’interno dell’organismo, principalmente ad opera di enzimi .

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'Metabolismo' - maris


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
metabolismo
Metabolismo
  • Il metabolismo di uno xenobiotico è l’insieme delle trasformazioni chimiche che la molecola subisce all’interno dell’organismo, principalmente ad opera di enzimi.
  • Il metabolismo ha una ‘logica’: trasformare la molecola in modo che possa essere facilmente escreta per via renale o biliare. Dato che le molecole idrofile sono eliminate più rapidamente di quelle lipofile, il metabolismo consiste principalmente nella trasformazione di molecole lipofile in molecole idrofile.
slide3
Le sostanze lipofile sono escrete più lentamente di quelle idrofile perché:
  • sono più facilmente riassorbite nel tubulo renale (o nell’intestino in caso di eliminazione biliare);
  • si accumulano nel tessuto adiposo
slide4

Durante il processo di formazione delle urine, si ha riassorbimento di acqua  aumento della concentrazione dei soluti nell’urina  gradiente di concentrazione urina-plasma  riassorbimento. Le sostanze lipofile sono riassorbite più facilmente perché attraversano meglio lo strato cellulare dell’epitelio tubulare.

slide5
E’ stato calcolato che il tempo di dimezzamento (emivita) dell’esobarbitale, che è pari a 5-6 ore, sarebbe, in assenza di trasformazione metabolica, di 2-5 mesi.
slide6
Il metabolismo degli xenobiotici è estremamente importante in Tossicologia, poiché può avere sia un effetto protettivo (eliminazione e/o detossificazione dello xenobiotico) sia un effetto dannoso (formazione di metaboliti tossici).
caratteristiche generali del metabolismo degli xenobiotici
Caratteristiche generali del metabolismo degli xenobiotici
  • In genere metabolizzano solo gli xenobiotici
  • Alcuni, tuttavia, sono coinvolti anche nella sintesi o degradazione di composti endogeni
slide8
Scarsa selettività per i substrati

 possibilità di metabolizzare un enorme numero di sostanze con un numero relativamente esiguo di enzimi

 uno xenobiotico può essere metabolizzato da enzimi diversi

 lo stesso enzima può catalizzare reazioni diverse sullo stesso substrato

 in genere uno xenobiotico viene metabolizzato secondo più vie metaboliche

slide11
 uno stesso enzima può metabolizzare più substrati compresenti nell’organismo  possibilità di interazioni (inibizione competitiva, induzione) tra xenobiotici, o tra xenobiotici e composti endogeni
esempio di interazione inibizione del metabolismo della terfenadina aritmie
Esempio di interazione: inibizione del metabolismo della terfenadina aritmie

Terfenadine

(Teldane)

Inibitori: succo di pompelmo, ketoconazolo ecc.

CYP3A4

Fexofenadine

(Telfast)

slide13
Una sostanza può inibire (o indurre) una via metabolica di un’altra sostanza, causando una variazione della composizione dei metaboliti
slide14

inibita da 2,6-dicloro-4-nitrofenolo

 aumento tossicità

inibito da cimetidina  diminuzione tossicità

variabilit degli enzimi metabolizzanti 1 variabilit interspecie
Variabilità degli enzimi metabolizzanti. 1Variabilità interspecie
  • In natura, gli xenobiotici con cui vengono in contatto gli organismi animali sono di origine vegetale.
  • La capacità di diverse specie animali di metabolizzare gli xenobiotici dipende dalla selezione operata dall’esposizione agli xenobiotici vegetali.
  • Ad es., insetti che si cibano di molte piante diverse possono metabolizzare una varietà di xenobiotici maggiore degli insetti che si alimentano di poche o una sola specie vegetale. I pesci hanno minore capacità metabolizzante dei mammiferi, probabilmente perché possono più facilmente eliminare gli xenobiotici tramite le branchie.
slide16

L’evoluzione degli isozimi CYP450 riflette l’esposizione ad un numero sempre maggiore di xenobiotici potenzialmente tossici, sintetizzati dai vegetali a scopo difensivo.

slide17
Specie diverse di mammiferi possono avere differenze quali-quantitative della capacità metabolizzante:

 importanti per l’estrapolazione all’uomo di dati animali.

  • la maggior parte delle differenze di tossicità tra specie diverse di mammiferi è dovuta a diversità del metabolismo.
variabilit degli enzimi metabolizzanti 2 variabilit intraspecie
Variabilità degli enzimi metabolizzanti. 2Variabilità intraspecie
  • All’interno di una specie, vi è una variabilità genetica, perché molti enzimi sono polimorfi (più varianti alleliche, con diversa attività; più copie dello stesso gene)

 differente suscettibilità agli effetti tossici

variabilit degli enzimi metabolizzanti 3 variabilit individuale
Variabilità degli enzimi metabolizzanti. 3Variabilità individuale
  • A livello individuale, la capacità metabolizzante è determinata, oltre che da fattori genetici, anche da fattori endogeni ed ambientali
  • fattori endogeni: età, sesso, stati fisiologici (ritmi circadiani, ciclo mestruale, gravidanza ecc.), patologie
  • fattori ambientali: induzione e inibizione enzimatica

variazioni della suscettibilità individuale

slide21
Gli effetti di un fattore di variabilità dipendono da tutti gli altri fattori.

Esempi:

  • Gli effetti di un inibitore di un enzima saranno più marcati in un individuo con un carenza genetica di quell’enzima.
  • Le differenze legate al sesso sono molto più forti nel ratto che nell’uomo.
distribuzione tissutale degli enzimi metabolizzanti
Distribuzione tissutale degli enzimi metabolizzanti
  • L’organo più ricco di enzimi metabolizzanti è il fegato.
  • Altri organi o tessuti con significativa capacità metabolica sono i polmoni, i reni, il sangue.
  • Alcuni tessuti hanno un’elevata concentrazione di enzimi metabolizzanti (mucosa nasale, cristallino), che servono a difendere il tessuto, ma il cui contributo al metabolismo sistemico è pressoché nullo dato il volume del tessuto.
slide23
La localizzazione degli enzimi è importante nel determinare l’organo colpito nel caso di formazione di metaboliti tossici. Molti metaboliti tossici sono infatti altamente reattivi e colpiscono quindi solo le cellule dell’organo in cui si formano. Ad es., molti composti sono epatotossici perché i metaboliti reattivi si formano nel fegato.
  • Inoltre, la tossicità è spesso limitata, all’interno dell’organo, alle cellule che esprimono l’enzima che porta alla formazione del metabolita tossico. Ad es., il paracetamolo e CCl4 causano necrosi centrolobulare perché le cellule della regione centrolobulare sono ricche di citocromo P450.
localizzazione intracellulare degli enzimi
Localizzazione intracellulare degli enzimi
  • Molti enzimi hanno diverse isoforme, che hanno spesso diversa localizzazione cellulare.
  • Una determinata isoforma ha in genere un’unica localizzazione intracellulare.
  • Nel fegato gli enzimi sono localizzati principalmente nel reticolo endoplasmatico (enzimi microsomiali) e nel citosol. Un numero minore di enzimi è localizzato nei mitocondri, nei lisosomi, nel nucleo.
classificazione delle reazioni di biotrasformazione fase i e fase ii
Fase I: reazioni di ossidazione, riduzione, idrolisi ecc.;

funzionalizzazione: introduzione o smascheramento di un gruppo nucleofilo;

formazione di elettrofili

Fase II: reazioni di coniugazione

coniugazione con ac. glucuronico, solfato, acetile, metile

coniugazione con glutatione

coniugazione con aminoacidi

Classificazione delle reazioni di biotrasformazione. Fase I e fase II.
slide26
Composti che già contengono un gruppo nucleofilo e composti elettrofili possono essere direttamente coniugati (fase II), ma possono anche subire reazioni di fase I (es. paracetamolo).
  • Le reazioni di fase II sono in genere più veloci di quelle di fase I  basse concentrazioni dei metaboliti di fase I
  • La capacità delle reazioni di fase I è limitata dalla attività enzimatica (quantità di enzima)
  • La capacità delle reazioni di fase II è limitata principalmente dalla disponibilità del cofattore
slide27
La maggior parte dei metaboliti tossici si forma nelle reazioni di fase I, in particolare nelle reazioni di ossidazione.
reazioni di fase i
Reazioni di fase I
  • Sono le reazioni di ossidazione, idrolisi, riduzione.
  • Portano in genere all’introduzione o smascheramento di un gruppo nucleofilo (-OH, -NH2, -SH, -COOH).
  • Ciò causa solo un modesto aumento dell’idrofilia. Tuttavia, il gruppo funzionale nucleofilo fornisce un punto di attacco per le reazioni di fase II.
  • Le reazioni di fase I determinano in genere perdita dell’attività farmaco-tossicologica (modificazione della struttura chimica e della capacità di interagire con il recettore). In alcuni casi, tuttavia, i prodotti delle reazioni di fase I sono biologicamente attivi.
  • Nelle reazioni di fase I, soprattutto le reazioni di ossidazione, si possono formare metaboliti tossici.
reazioni di ossidazione degli xenobiotici
Reazioni di ossidazione degli xenobiotici
  • L’ossidazione è la trasformazione più frequente negli xenobiotici (>75% delle reazioni di fase I)
  • Le reazioni di ossidazione sono catalizzate principalmente da 7 enzimi, che differiscono per:
  • i substrati ossidati (ma spesso un substrato può essere ossidato da più enzimi, es. etanolo);
  • localizzazione tissutale e intracellulare;
  • attività
citocromo p450 cyp 450
Citocromo P450 (CYP 450)
  • E’ l’enzima più importante di fase I perché metabolizza un gran numero di xenobiotici  principale responsabile dell’inattivazione di molti farmaci e tossici diretti.
  • Coinvolto anche nella biosintesi o degradazione di molti composti endogeni (ormoni steroidei, TXA2, PGI2, vitamine liposolubili, acidi grassi ecc.)
  • Presente in tutti i tessuti. I livelli più alti sono nel fegato, a livello del reticolo endoplasmatico (frazione microsomiale)
slide33
Reazione generale:

RH (substrato) + O2 + NADPH + H+ ROH + H2O + NADP+

  • E’ una reazione di monoossigenazione in cui un atomo di ossigeno è incorporato nel substrato; l’altro atomo di O è ridotto ad H2O (CYP450 è quindi un’ossidasi a funzione mista), con l’apporto degli equivalenti riducenti (elettroni) provenienti da NADPH.
  • Il prodotto ROH può subire riarrangiamenti molti prodotti finali, diversi da alcol e fenoli.
slide34
CYP450 lega direttamente il substrato e O2.
  • I 2 elettroni provenienti da NADPH arrivano al complesso CYP450-substrato tramite una flavoproteina, la NADPH-citocromo P450 reduttasi.
  • Il secondo elettrone può provenire anche dal citocromo b5.
slide36

amino ossidasi

Reazioni catalizzate dal CYP450:

C-ossidazione: idrossilazione alifatica e aromatica. Epossidazione

Ossigenazione di un eteroatomo. De-alchilazione di un eteroatomo

Trasferimento di un gruppo ossidativo.

Scissione di esteri. Deidrogenazione. Riduzione

ossidazione di composti insaturi formazione di epossidi
Ossidazione di composti insaturi: formazione di epossidi
  • Anelli aromatici e alcheni possono essere ossidati ad epossidi.
  • L’epossido può isomerizzare a fenolo (aromatici) o a enolo o aldeide (alifatici), non tossici.
  • Gli epossidi sono in genere (molto) reattivi e si legano ai gruppi nucleofili di proteine e DNA. Es.: bromobenzene, epatotossico; aflatossina B1, cancerogeno.
  • Gli epossidi di diversi alcheni e alchini, tra cui farmaci come etinilestradiolo, norgestrel, pargilina ecc. sono molto reattivi e si legano al gruppo eme del CYP450, inattivandolo (inibitori suicidi).
slide38
I carboni aromatici alogeno-sostituiti non sono ossidati o sono ossidati molto lentamenteresistenza al metabolismo  bioaccumulazione (DDT, diossine ecc.)
slide39
Gli epossidi di alcheni alogenati sono instabili e per trasposizione formano aldeidi alogenate, che possono essere poi ossidate o ridotte.
  • La tossicità dipende anche dalla velocità di trasposizione; ad es., il tricloroetene è relativamente poco tossico perché l’epossido traspone velocemente, e l’aldeide viene rapidamente metabolizzata
ossidazione di idrocarburi policiclici aromatici ipa
Ossidazione di idrocarburi policiclici aromatici (IPA)
  • Dato l’alto numero di posizioni ossidabili, il metabolismo è molto complesso. E’ stato molto studiato perché diversi IPA diventano cancerogeni potenti dopo bioattivazione.
  • L’ossidazione avviene prevalentemente nelle regioni ad alta densità elettronica (regione L) o in cui si trovano doppi legami con carattere prevalentemente olefinico (regione K).
  • Sono difficilmente ossidati i legami degli anelli terminali, con carattere prevalentemente aromatico, ed i legami adiacenti ai punti di fusione tra gli anelli.
slide41
Spesso si hanno epossidazioni successive in posizioni diverse.
  • Gli epossidi che si formano nelle regioni ‘Baia’ (Bay region) non sono attaccabili dall’epossido idrolasi e dalla glutatione-S-transferasi  cancerogenesi (es., benzo[a]pirene)
ossidazione di eteroatomi da parte di cyp450
Ossidazione di eteroatomi da parte di CYP450

Composti solforati

  • Mercaptani  alcoli
  • Tioeteri  solfossidi ( solfoni)
  • Solfossidi  solfoni

Gli intermedi R-S-OH (acidi solfonici) sono reattivi, potenzialmente tossici

Reazioni catalizzate anche dalle monoossigenasi flaviniche (FMO)

n ossidazione
N-ossidazione

Reazioni catalizzate da CYP450 e/o FMO

  • Formazione di N-ossidi. P450: N ricchi di elettroni (piridine, chinoline); FMO: N poveri di elettroni (amine terziarie)
  • Formazione di N-idrossilamine: amine aromatiche primarie e secondarie. Le N-idrossilamine possono essere O-coniugate con gruppi acetile o solfato  uscita di di gruppi acetossi o solfato  ioni nitrenio reattivi  metaboliti cancerogeni. Le N-idrossilamine aromatiche possono anche essere ossidate a nitroso- e nitro-composti
slide45
N-dealchilazione (amine alifatiche primarie e secondarie): catalizzata solo da CYP450.
  • In generale, CYP450 catalizza la N-dealchilazione perché l’intermedio è un radicale cationico instabile  perdita di un protone in alfa  idrossilazione del C-alfa  dealchilazione (formazione dell’aldeide)
  • Ovviamente questo meccanismo non avviene se non ci sono protoni in alfa (amine terziarie, aromatiche primarie) o se il radicale cationico è stabilizzato da gruppi elettron-donatori.
slide46
La dealchilazione di metil-amine porta alla formazione di formaldeide  acido formico  CO2.
  • Misurando la quantità di 13CO2 dopo somministrazione di un amina marcata con 13C sul metile (es. eritromicina) si può misurare l’attività di CYP450 in vivo.
slide47
Dealchilazione di nitrosoamine: porta alla formazione di un diazoidrossido  diazoione  catione alchilico  cancerogenesi. La formazione di nitrosoamine può avvenire in vivo, a partire da amine secondarie e nitriti, catalizzata dal pH acido dello stomaco.
  • L’ossidazione delle idrazine forma composti instabili che decompongono con formazione di cationi (o radicali) alchilici  cancerogenesi (1,2 dimetilidrazina), epatotossicità (isoniazide)
dealogenazione di idrocarburi alogenati
Dealogenazione di idrocarburi alogenati
  • Dealogenazione ossidativa, seguita da eliminazione di HX, con formazione di alogenuri acilici o aldeidi
  • Dealogenazione riduttiva: sostituzione dell’atomo di alogeno con H. Anche la riduzione è catalizzata da CYP450, quando la tensione di O2 è bassa.

All’aumentare dei sostituenti alogenati aumenta il potenziale di ossidazione  preferenzialmente riduzione

  • Rimozione di due atomi di alogeno adiacenti  alchene
metaboliti tossici delle reazioni di dealogenazione
Metaboliti tossici delle reazioni di dealogenazione
  • La dealogenazione riduttiva di CCl4 ed altri idrocarburi alogenati ha come intermedio il radicale CCl3. perossidazione lipidica
  • Si formano inoltre altri metaboliti tossici, come il fosgene

tossicità epatica e renale

Nella terapia dell’avvelenamento da CCl4 si somministra O2 per inibirne la riduzione.

slide50
Alotano
  • Dealogenazione riduttiva  radicale perossidazione epatotossicità diretta, con severità specie-dipendente (severa nel ratto, lieve nella cavia)
  • Dealogenazione ossidativa  formazione di cloruro di trifluoroacetile  addotti proteici  formazione di neoantigeni  epatite immuno-mediata nell’uomo (e nella cavia).
  • Rara, si manifesta dopo esposizione ripetuta. Sensibilizzazione crociata con enflurano e forse altri anestetici alogenati  l’enflurano causa epatotossicità in soggetti precedentemente esposti ad alotano
deidrogenazione
Deidrogenazione
  • Formazione di doppi legami C=C, C=O, C=N.
  • Nel caso del paracetamolo ed altri aminofenoli, le deidrogenazione porta alla formazione di benzochinonimmine, elettrofile e citotossiche. Possono essere detossificate dalla glutatione-S-transferasi.
deaminazione ossidativa
Deaminazione ossidativa
  • E’ la stessa reazione catalizzata dalle MAO:

I CYP catalizzano la deaminazione anche di substrati con bassa affinità per le MAO (es.: amfetamina)

slide53

Nell’uomo, esistono 60 o più enzimi CYP450, che differiscono, parzialmente, per specificità, induttori, inibitori.

Membri della stessa sotto-famiglia possono avere omologia di sequenza fino al 97%

slide54

Nell’uomo la variabilità inter- ed intrandividuale è molto marcata.

Negli animali da esperimento ci sono anche forti differenze legate al ceppo  tossicità ceppo-specifica

distribuzione nelle specie animali e nomenclatura
Distribuzione nelle specie animali e nomenclatura
  • Quasi tutti i CYP non sono presenti in tutte le specie (mammifere).
  • I nomi (numeri) dei CYP sono assegnati in ordine cronologico, indipendentemente dalla specie in cui sono stati identificati

 nomenclatura specie-specifica

slide57
Ciascun enzima è caratterizzato dai substrati metabolizzati, dagli induttori ed inibitori.
  • Tuttavia, data la scarsa specificità delle varie forme, 2 o più forme possono partecipare al metabolismo di un singolo xenobiotico.
  • Le varie forme possono catalizzare reazioni diverse sullo stesso substrato.
  • In molti casi predomina il metabolismo operato da una forma. Il contributo delle varie isoforme dipende dai valori di Km e Vmax.
cyp e metabolismo dei farmaci
CYP e metabolismo dei farmaci
  • Scarsa selettività  in vitro un farmaco può essere metabolizzato da più CYP
  • Tuttavia, gli studi su individui con fenotipo ‘cattivo metabolizzatore’ per un determinato CYP hanno mostrato che per molti farmaci in vivo il metabolismo è catalizzato in modo predominante da un solo enzima, che controlla quindi la velocità di eliminazione.
  • Ciò è dovuto alle diverse Km e Vmax dei vari enzimi
reaction phenotyping
Reaction phenotyping
  • Per determinare quale CYP è il principale responsabile del metabolismo:
  • Analisi della correlazione tra velocità di metabolismo e contenuto dei vari CYP di campioni microsomiali epatici umani.
  • Uso di inibitori selettivi (rari) o di anticorpi contro un enzima
variabilit del cyp450
Variabilità del CYP450
  • Fattori genetici
  • Se il metabolismo di un farmaco è regolato principalmente da un solo gene (un solo enzima o isoenzima), si possono avere 4 casi generali:
  • 1. Il gene è presente in una sola forma, espressa in modo simile in tutti gli individui;
  • 2. Il gene è presente, nella popolazione, in due o più forme (alleli), i cui prodotti hanno attività enzimatica nettamente diversa;
  • 3. Il gene è presente in una sola forma ma mutazioni dei geni regolatori causano una marcata riduzione dell’espressione genica.
  • 4. In una frazione di popolazione, il gene è presente in più copie.
slide61
Nel caso 1), la variabilità è determinata da fattori non genetici e la distribuzione della capacità metabolizzante nella popolazione sarà normale (gaussiana).
  • Nei casi 2), 3) e 4) si osserva una distribuzione non normale (polimodale); sono presenti due o più popolazioni (ciascuna con distribuzione normale). Sono quindi presenti almeno due o più fenotipi.
  • In questo caso si ha polimorfismo genetico (se il fenotipo più raro ha una frequenza minore dell’1% si usa la definizione fenotipi rari).
  • Gli enzimi per cui si presenta questo fenomeno sono detti polimorfi.
slide63

FARMACOGENETICA

  • Fattori genetici che influenzano l’effetto dei farmaci sono: enzimi farmaco metabolizzanti, trasportatori dei farmaci, recettori, canali ionici
  • L’alterazione genetica che determina un’alterata risposta al farmaco generalmente rimane stabile all’interno di un individuo per tutta la vita
slide64

Farmacogenetica CYP ed effetti avversi ai farmaci

  • Le forme polimorfiche di CYP450 sono responsabili dello sviluppo di un numero significativo di reazioni avverse ai farmaci.
  • Il 59% dei farmaci più citati in studi che esaminavano reazioni avverse erano metabolizzati da enzimi polimorfici di fase I; il 20% non era substrato di enzimi polimorfici . I farmaci metabolizzati da enzimi polimorfi sono il 7-22% del totale.
  • Phillips et al. (2001) J. Am. Med. Assoc. 286, 2270–2279
slide65

Farmacogenetica CYP e successo farmacoterapeutico

  • I costi registrati nel trattamento dei pazienti con forme polimorfiche di CYP450 sono più alti rispetto a quelli non polimorfici.
  • A causa del polimorfismo il numero dei “non-responders” ad una terapia farmacologica è alto e sembra rappresenti il 30-60% dei soggetti trattati con farmaci
slide66

Classificazione dei soggetti

  • Se sono presenti solo due alleli, si possono avere, in generale, 4 fenotipi
  • Metabolizzatori lenti (PMs): soggetti omozigoti per l’allele che codifica per un enzima inattivo o a bassa attività.
  • Metabolizzatori intermedi (IMs): soggetti eterozigoti per un allele che provocano una ridotta attività dell’enzima; osservabile solo se nessuno dei due alleli è dominante
  • Metabolizzatori estensivi (EMs): soggetti omozigoti per l’allele che codifica per l’enzima con attività normale.
  • Metabolizzatori ultrarapidi (UMs): soggetti che presentano copie multiple di un gene (dominante ereditario)
slide67
Solo per alcuni farmaci sono individuabili 4 fenotipi; per altri sono individuabili 2 o 3 fenotipi (mancano gli ultrarapidi e/o gli intermedi)
  • Se sono presenti più di due alleli di un gene, ciascuno codificante per un enzima con attività diversa, non sono osservabili fenotipi chiaramente distinguibili, ma si osserva piuttosto una distribuzione unimodale.
  • La frequenza di un allele variante nelle popolazioni mostra in genere notevoli variazioni interetniche.
polimorfismo del cyp2d6 polimorfismo di idrossilazione della debrisochina sparteina
POLIMORFISMO del CYP2D6 (POLIMORFISMO DI IDROSSILAZIONE DELLA DEBRISOCHINA/SPARTEINA)
  • Il primo indizio derivò dall’osservazione che le concentrazioni plasmatiche di alcuni antidepressivi triciclici presentavano una variabilità interindividuale di più di 30 volte, a parità di dose/kg somministrata. Inoltre, alcuni pazienti sembravano appartenere ad una popolazione distinta, dal punto di vista farmacocinetico.
  • Successivamente, si osservò che una certa percentuale di individui aveva una deficienza nel metabolismo ossidativo della debrisochina (4-ossidazione) e della sparteina (N-ossidazione). Queste due reazioni enzimatiche sono catalizzate dal CYP2D6, che catalizza anche l’ossidazione di alcuni triciclici.
slide71
La capacità metabolizzante individuale si misura in base al rapporto tra le concentrazioni urinarie della debrisochina (non metabolizzato) e della 4-idrossidebrisochina (metabolita) dopo somministrazione di una singola dose.  Questo rapporto è detto rapporto metabolico.
  • In base a questo rapporto, una percentuale di individui pari al 5-10% (nei caucasici) è composta da ‘cattivi metabolizzatori’.
  • Il polimorfismo del CYP2D6 presenta notevoli variazioni interetniche. In particolare, negli asiatici la percentuale di cattivi metabolizzatori è pari all’1%; inoltre, i buoni metabolizzatori asiatici hanno una capacità metabolica inferiore a quelle dei buoni metabolizzatori caucasici. Le popolazioni nere differiscono sia dai caucasici sia dagli asiatici.
slide73

Rapporto fenotipo-etnia nel metabolismo dipendente da CYP450

Etnia Metabolizzatori

Lenti Rapidi

Caucasici

CYP2D6 5-10 1-10 10% Italia

1% N Europa

Asiatici

CYP2D6 1 0-2

Africani

CYP2D6 0-20 2

Etiopi/Arabi

CYP2D6 1,8-2 10-29

slide74
Studi familiari hanno dimostrato che i cattivi metabolizzatori sono omozigoti per un gene recessivo autosomico.
  • Sono stati identificati gli alleli mutati che causano carenza del CYP2D6.
  • L’analisi del genotipo (analisi del DNA dei leucociti) consente ora di stabilire con accuratezza il fenotipo.
  • Sono state identificate varianti geniche con duplicazione o amplificazione del gene codificante per l’enzima, varianti associate a capacità metabolica ultrarapida.
slide76
CONSEGUENZE DEL POLIMORFISMO DEL CYP2D6
  • Il CYP2D6 metabolizza molti farmaci di notevole importanza clinica e con discreta tossicità potenziale: antidepressivi triciclici, antipsicotici, molti antiaritmici, β-bloccanti lipofili, oppiacei. L’influenza del polimorfismo del CYP2D6 dipende dall’importanza dell’ossidazione catalizzata da questo enzima sull’eliminazione del farmaco.
  • I cattivi metabolizzatori corrono quindi il rischio di sviluppare effetti avversi con dosi ‘ordinarie’ di farmaco.
  • D’altra parte, in soggetti con capacità metabolizzante molto rapida, dosi ordinarie possono determinare concentrazioni plasmatiche sub-terapeutiche e quindi un effetto clinico inadeguato, come nel caso degli antidepressivi triciclici.
conseguenze tossicologiche non legate ai farmaci del polimorfismo del cyp2d6
Conseguenze tossicologiche, non legate ai farmaci, del polimorfismo del CYP2D6
  • Il CYP2D6 partecipa al metabolismo di:
  • organofosforici
  • atrazina
  • MPTP

I cattivi metabolizzatori potrebbero essere più sensibili agli effetti tossici di queste sostanze.

I cattivi metabolizzatori professionalmente esposti a pesticidi (organofosforici) sembrano avere un più alto rischio di sviluppare il morbo di Parkinson

slide79

Altri CYP polimorfi

Attualmente, l’importanza clinica e tossicologica di questi polimorfismi non è chiara.

altre enzimi ossidativi
Altre enzimi ossidativi

Monoossigenasi contenenti flavina (FMO)

  • Catalizzano la monoossigenazione di eterotaomi (N, S, P)  molte reazioni possono essere catalizzate anche dal CYP450.
  • Uno xenobiotico può essere metabolizzato in modo diverso in specie diverse in dipendenza del contenuto dei CYP450 e degli enzimi FMO.
  • Es.: gli alcaloidi pirrolizidinici sono epatotossici nel ratto (e nell’uomo) perché sono ossidati a metaboliti tossici da un CYP450. Nella cavia, l’attività di questo enzima è bassa e gli alcaloidi sono ossidati dalle FMO, con formazione di metaboliti non tossici.
slide81

Gli alcaloidi pirrolizidinici attivati possono legarsi a proteine (epatotossicità) e al DNA (mutagenicità, cancerogenicità?)

slide82
Reazioni:
  • N-ossidazioni:
  • amine primarie  idrossilamine ( ossime)
  • amine secondarie  idrossilamine ( nitroni)
  • amine terziarie  N-ossidi
slide84
Composti solforati:
  • tioli  disolfuri
  • disolfuri  solfossidi
  • solfossidi  solfoni

I composti solforati possono formare metaboliti elettrofili tossici:

R-SH  R-SOH (ac. solfonico) elettrofilo.

Es.: tiobenzamide, spironolattone.

Spironolactone side effects:

Liver/biliary:A very few cases of mixed cholestatic/hepatocellular toxicity, with one reported fatality, have been reported with spironolactone administration.

slide85
I metaboliti elettrofili formati dalle FMO non inibiscono le FMO ma possono inibire irreversibilmente i CYP.
  • Nell’uomo sono presenti 5 FMO (1-5).
  • Non sono inducibili da sostanze esogene ma la loro attività è regolata dagli ormoni sessuali.
  • La carenza di FMO3 provoca la sindrome dell’odore di pesce, dovuta alla mancata ossidazione della trimetilamina endogena, che viene escreta nelle urine, sudore, alito. Non si sa se questa carenza provochi conseguenze tossicologiche.
perossidasi co ossidazione perossidasi dipendente
Perossidasi (co-ossidazione perossidasi-dipendente)
  • Le perossidasi hanno una distribuzione ubiquitaria e sono presenti anche in tessuti in cui i livelli di CYP450 sono bassi o nulli: rene, midollo osseo, polmone ecc.
  • L’ossidazione da parte delle perossidasi è responsabile della tossicità extra-epatica di molti xenobiotici (che in genere hanno anche tossicità epatica CY450-dipendente; es.: paracetamolo, aflatossina B1).
  • Le perossidasi svolgono importanti ruoli fisiologici (formazione di PGs, ossidazione di I-, danneggiamento di microrganismi ecc.)
prostaglandina h sintasi phs
Prostaglandina H sintasi (PHS)
  • E’ la perossidasi più importante per la bioattivazione di xenobiotici.
  • Ha due attività catalitiche: un’attività cicloossigenasica che converte l’acido arachidonico in PGG2, che è ha sia un gruppo endoperossido ciclico sia un gruppo perossido; la seconda attività è quella perossidasica, che converte PGG2 in PGH2, riducendo il gruppo OOH a OH e ossidando un substrato.

X o 2 XH

XO o 2X. + H2O

slide88
La PHS quindi catalizza sia la formazione di un perossido sia l’ossidazione di uno xenobiotico da parte del perossido.
  • Le altre perossidasi non catalizzano la formazione di perossidi.
reazioni catalizzate dalle perossidasi
Reazioni catalizzate dalle perossidasi

Due tipi di reazione. In entrambi i casi il perossido può essere H2O2 o un ROOH

  • Trasferimento di O dal perossido al substrato.

Es.: ossidazione di Aflatossina B1 

8,9 epossido, cancerogeno

Se l’ossidazione avviene nel fegato, ad opera di CYP450  tumori epatici (uomo)

se avviene nel rene, ad opera di PHS  tumori renali (ratto)

slide90
Es.: epossidazione del benzo[a]pirene 7,8 diidrodiolo.

N.B. la PHS può catalizzare solo la seconda epossidazione del BP, CYP450 catalizza entrambi gli step. La seconda ossidazione può avvenire anche ad opera della 15-lipoossigenasi (alti livelli nell’epitelio polmonare) e di radicali perossilici (‘alti’ livelli nella pelle per perossidazione lipidica)  BP provoca tumori polmonari e cutanei.

I radicali perossilici si formano nel secondo tipo di reazione catalizzato dalle perossidasi e possono ossidare altri substrati (es. fenilbutazone ossida BP diidrodiolo).

slide91
2) Ossidazione con formazione di intermedi radicalici (amine, fenoli, composti insaturi coniugati):

Es. paracetamolo  tossicità renale

Amine aromatiche  radicale  dimeri

Tumore della vescica (uomo, cane)

Amine aromatiche  N-idrossilamina  O-acetilazione  ione nitronio  tumori epatici (ratto)

slide92
Benzene.
  • L’effetto mielosoppressivo è bloccato da indometacina.
  • Fenolo e idrochinone da soli non sono mielosoppressori ma lo diventano se co-somministrati  stimolazione da parte del fenolo dell’attivazione PHS-dipendente dell’idrochinone.
deidrogenasi
Deidrogenasi

Alcol deidrogenasi (ADH)

Ossidazione di alcol alifatici e aromatici ad aldeidi:

ROH + NAD  RCHO + NADH + H+

Alcol primari: veloce

secondari: lenta

terziari: praticamente nulla.

slide94
ADH è un enzima citosolico; è un omo- o etero-dimero; 5 tipi di subunità (, , , , )  molti isoenzimi, suddivisi in tre classi.
  • La classe I è quella più importante nell’ossidazione dell’etanolo.
  • Il metanolo è ossidato molto più lentamente dell’etanolo; dato che la tossicità del metanolo è dovuta alla sua ossidazione a formiato  etanolo usato come antidoto (inibizione competitiva) nelle intossicazioni da metanolo.
slide95
ADH gastrica: eliminazione pre-sistemica, limita la biodisponibilità orale dell’etanolo.
  • I livelli gastrici di ADH sono diminuiti dal digiuno  maggiore effetto di etanolo a digiuno.
  • Nelle donne e negli alcolisti i livelli di ADH gastrica sono più bassi  maggiore biodisponibilità.
slide96
Gli isoenzimi di classe I che contengono almeno una subunità beta sono molto attivi nei confronti dell’etanolo  ADH ‘atipica’, che porta alla conversione molto rapida ad acetaldeide. Presente nell’85% di cinesi e giapponesi, in percentuali molto minori in altre razze (0-20%).
aldeide deidrogenasi aldh
Aldeide deidrogenasi (ALDH)
  • Ossida le aldeidi ad acidi, utilizzando NAD come co-fattore
  • Tre classi: ALDH1 e 3 sono citosoliche, ALDH2 è mitocondriale ed è la principale responsabile dell’ossidazione dell’acetaldeide (bassa Km).
  • ALDH2 è polimorfa; in un alta percentuale (~50%) di giapponesi, cinesi e vietnamiti è presente una variante ALDH2 a bassa attività, per una mutazione puntiforme.
  • Dato che in queste popolazioni vi è un’elevata prevalenza di ADH atipica, molti soggetti hanno tossicità da acetaldeide (flushing syndrome) dopo assunzione di etanolo
slide98
L’ALDH è inibita da diverse sostanze; il disulfiram è (stato) utilizzato nella disuassefazione degli alcolisti.
  • In generale le aldeidi sono più tossiche dei rispettivi alcol. Una delle più tossiche è l’acroleina (CH2=CHCHO, epatotossica), che si forma per ossidazione dell’alcol allilico.
  • La tossicità del metanolo e del glicole etilenico è invece dovuta alla loro ossidazione ad acido formico e ossalico.
slide99
Monoaminoossidasi (MAO),diaminoossidasi, poliamminoossidasi
  • Catalizzano la deaminazione ossidativa delle ammine ad aldeidi; le aldeidi possono poi essere ridotte od ossidate.
  • Importanti nel metabolismo di ammine endogene (nor-adrenalina, serotonina, spermina, putresceina ecc.) ed esogene. Metabolizzano anche alcuni farmaci e xenobiotici
  • La formazione delle neurotossina MPP+ a partire da MPTP è catalizzata dalla MAO-B
slide100

MPP+

MPTP (IV) is a byproduct sometimes formed in the illicit synthesis of MPPP (III), a narcotic

Il paraquat è un erbicida che ha una struttura simile a MPP+. Alcuni studi epidemiologici hanno evidenziato un aumento di incidenza di Parkinsonismo in soggetti esposti professionalmente agli erbicidi.

reazioni di fase i riduzioni
Reazioni di fase I - Riduzioni

Gruppi azo e nitro:

  • Sono ridotti da: 1) microflora intestinale (bassa tensione di O2); 2) DT diaforasi; 3) CYP450 (con bassa tensione di O2)
  • La riduzione dei nitrogruppi svolge un ruolo importante nella tossicità di alcuni composti nitroaromatici (es., dinitrotoluene, epatocancerogeno nel ratto).
slide103
Chinoni
  • La riduzione completa (2 e-) ad idrochinoni è detossificante perché i chinoni sono elettrofili reattivi. Questa reazione è catalizzata dalla DT-diaforasi (NADPH-chinone reduttasi).
  • La riduzione parziale (1 e-) a semichinoni radicalici, da parte della NADPH citocromo P450 reduttasi, porta alla formazione di radicali tossici, sia direttamente sia per formazione anione superossido (e di ROS)  tessuti con bassi livelli di SOD (es. cuore) sono particolarmente sensibili agli effetti tossici dei chinoni.
  • Gli idrochinoni possono andare incontro ad autoossidazione (non enzimatica), con formazione di radicali semichinonici e chinoni, potenzialmente tossici. La suscettibilità all’autoossidazione è determinata dalla struttura dell’intera molecola.
slide104
La DT diaforasi detossifica anche altri xenobiotici potenzialmente reattivi quali: epossidi chinonici, chinnoneimmine, C-nitroso arilammine, composti contenenti il gruppo azo-.
  • E’ un enzima inducibile
slide105
Epossido idrolasi. Catalizza l’addizione trans di H2O agli epossidi formati (dal citocromo P450) nelle reazioni di ossidazione di alcheni e composti arilici  trans dioli
  • Dato che questi epossidi sono quasi tutti altamente reattivi e tossici (cancerogeni), le epossido idrolasi sono enzimi detossificanti molto importante.
  • Sono ampiamente distribuiti nell’organismo; all’interno di alcuni tessuti, la loro distribuzione è parallela a quelle del citocromo P450  rapida detossificazione degli epossidi.
  • Alcuni epossidi non possono essere metabolizati dall’epossido idrolasi per ragioni steriche (v. bay region) e sono quindi particolarmente tossici (es., benzopirene-9,10-epossido).
slide106
L’epossido idrolasi è un enzima inducibile. La sua induzione è sempre associata a quella del citocromo P450.
  • Può essere inibito da alcuni epossidi e da alcuni farmaci  aumento della tossicità di altri xenobiotici metabolizzati ad epossidi (es. valproato aumenta tossicità di carbamazepina).
idrolisi
Idrolisi
  • Carbossilesterasi (esterasi). Idrolisi di esteri (veloce), amidi (lenta) esteri tiolici, esteri fosforici, anidridi acide.

Es.: RCOOR1 + H2O  RCOOH + R1OH

  • Le esterasi sono enzimi poco specifici. Oltre agli xenobiotici, metabolizzano anche composti endogeni.
  • Sono ampiamente distribuite nell’organismo; i livelli più alti si trovano nel fegato, plasma ed eritrociti, rene (tubulo prossimale), polmone.
  • In alcuni casi l’idrolisi porta alla formazione di composti reattivi.
slide108
Le carbossilesterasi idrolizzano o legano i pesticidi organofosforici  detossificazione.
  • Vi è una relazione inversa tra attività carbossilesterasica e suscettibilità agli organofosforici  differenze interspecie.
  • Transesterificazione della cocaina in presenza di etanolo  l’estere etilico è più attivo e più lipofilo aumento della mortalità e tossicità epatica
pseudocolinesterasi
Pseudocolinesterasi
  • La pseudocolinesterasi (o butirrilcolinesterasi) è un’esterasi ampiamente distribuita nell’organismo. L’enzima plasmatico è responsabile dell’inattivazione di alcuni farmaci, tra cui il suxametonio (bloccante neuromuscolare depolarizzante a breve durata d’azione).
  • Circa 1/3000 individui hanno una variante dell’enzima che idrolizza il suxametonio molto lentamente  blocco neuromuscolare duraturo (ore).
  • Questa variante dell’enzima è inibita dalla dibucaina meno dell’enzima normale
  • E’ possibile identificare gli individui con la variante anomala misurando il numero di dibucaina, che esprime l’inibizione percentuale della pseudocolinesterasi da parte di dibucaina 10-5 M
reazioni di fase ii
Reazioni di fase II
  • Sono reazioni di coniugazione. Alcune aumentano l’idrofilia (glucuronidazione, solfatazione, acetilazione)
  • L’acetilazione e la metilazione possono diminuire l’idrofilia ma possono proteggere dalla formazione di metaboliti reattivi.
slide111
Coniugazione di nucleofili:
  • glucuronidazione
  • solfatazione
  • acetilazione
  • metilazione
  • coniugazione con aminoacidi (glicina, taurina, acido glutammico)
  • Coniugazione di elettrofili:
  • coniugazione con glutatione (formazione di acidi mercapturici)
slide112
Le reazioni coniugative richiedono energia, che viene fornita come ‘attivazione’ del cofattore coniugativo (coniugazione di nucleofili) o ‘attivazione’ dello xenobiotico (coniugazione di elettrofili.