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Microscopia Confocal: Teoria e técnica

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  1. 1. Energia radiante = Radiação eletromagnética Natureza da radiação eletromagnética Espectro eletromagnético. Natureza dual: onda/partícula 2. Fluorescência. Interação radiação eletromagnética-matéria. Luminescência: fluorescência e fosforescência. Fluorescência: Diagrama de Jablonski. Fluoróforos. 3. Microscopia de transmissão 4. Microscopia de fluorescência “wide-field” 5. Microscopia confocal 6. Técnicas especiais: proteínas de fusão. Microscopia Confocal: Teoria e técnica A. C. Cassola

  2. Microscopia de transmissão Microscopia de fluorescência wide-field Microscopia confocal Práticas Bibliografia Lakowicz, J.R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy. 2nd Edition. 1999. Kluver Academic/Plenum Publishers, New York. Lichtman, J.W., Conchello, J-A. Fluorescence microscopy. Nature Methods, 2(12):910- 919, 2005. Conchello, J-A., Lichtman, J.W. Optical sectioning microscopy. Nature Methods, 2(12):920-931/ A. C. Cassola

  3. 1. Energiaradiante = Radiaçãoeletromagnética Naturezadaradiaçãoeletromagnética Espectroeletromagnético. Natureza dual: onda/partícula 2. Fluorescência. Interaçãoradiaçãoeletromagnética-matéria. Luminescência: fluorescência e fosforescência. Fluorescência: Diagrama de Jablonski. Fluoróforos. 3. Microscopia de transmissão 4. Microscopia de fluorescência “wide-field” 5. Microscopia confocal 6. Técnicasespeciais: proteínas de fusão. Microscopia Confocal: Teoria e técnica A. C. Cassola

  4. Ondas mecânicas em um meio elástico Meio: Massa (inércia) Elasticidade A. C. Cassola

  5. Energia Radiante – Radiação eletromagnética. Carregam energias elétrica e magnética • Propriedades do meio de propagação: • Armazenar energia elétrica (capacitância) • Armazenar enérgia magnética • (indutância) Vácuo Permitividade e0=8.85*10-12F/m Permeabilidade m0=4p*10-12H/m A. C. Cassola

  6. Energia Radiante – Radiação eletromagnética. Velocidade da onda Frequência (ciclos por s, Hz) A. C. Cassola

  7. Espectro da radiação eletromagnética A. C. Cassola

  8. Onda: Refração A. C. Cassola

  9. photon is the quantum of the electromagnetic interaction and the basic "unit" of light and all other forms of electromagnetic radiation and is also the force carrier for the electromagnetic force. Fóton A. C. Cassola

  10. 1. Energiaradiante = Radiaçãoeletromagnética Naturezadaradiaçãoeletromagnética Espectroeletromagnético. Natureza dual: onda/partícula 2. Fluorescência. Interaçãoradiaçãoeletromagnética-matéria. Luminescência: fluorescência e fosforescência. Fluorescência: Diagrama de Jablonski. Fluoróforos. 3. Microscopia de transmissão 4. Microscopia de fluorescência “wide-field” 5. Microscopia confocal 6. Técnicasespeciais: proteínas de fusão. Microscopia Confocal: Teoria e técnica A. C. Cassola

  11. Interação radiação EM-matéria: reflexão A. C. Cassola

  12. Interação radiação EM-matéria: refração A. C. Cassola

  13. Interação radiação EM-matéria: difração A. C. Cassola

  14. Luminescência – Fluorescência e fosforescência A. C. Cassola

  15. A. C. Cassola

  16. Luminescência – Fluorescência e fosforescência Diagrama de Jablonski A. C. Cassola

  17. Fluoróforos de interesse em Biologia Quinina Fluoresceína lexc=490nm lem=514nm 250nm 350nm lexc lem =450nm Rodamina Acridina lexc=495nm lem=526nm lexc=530nm lem=556nm A. C. Cassola

  18. Espectro da HBO (mercury-vapor high pressure arc lamp) Fontes de “luz”: Laser x HBO Espectro do He-Ne laser Laser (Light Amplification by Stimulated Emission Radiation) Laser é um instrumento óptico-eletrônico que emite radiação coerente (fase relativa constante), em um feixe estreito, de baixa divergência, em um comprimento de onda definido (monocromático) A. C. Cassola

  19. 1. Energiaradiante = Radiaçãoeletromagnética Naturezadaradiaçãoeletromagnética Espectroeletromagnético. Natureza dual: onda/partícula 2. Fluorescência. Interaçãoradiaçãoeletromagnética-matéria. Luminescência: fluorescência e fosforescência. Fluorescência: Diagrama de Jablonski. Fluoróforos. 3. Microscopia de transmissão 4. Microscopia de fluorescência “wide-field” 5. Microscopia confocal 6. Técnicasespeciais: proteínas de fusão. Microscopia Confocal: Teoria e técnica A. C. Cassola

  20. Dimensões na Biologia A. C. Cassola

  21. Microscopia - Objetivas A. C. Cassola

  22. Abertura numérica e aumento A. C. Cassola

  23. Resolução A. C. Cassola

  24. Difração limita a resolução – Airy disks A. C. Cassola

  25. Resolução e refração do meio A. C. Cassola

  26. Resolução A. C. Cassola

  27. Aumento e Resolução A. C. Cassola

  28. Microscopia de luz refletida A. C. Cassola

  29. Microscopia de luz transmitida A. C. Cassola

  30. Iluminaçao – Sistema Köhler A. C. Cassola

  31. Técnicas especiais: Contraste por Interferência DiferencialDIC A. C. Cassola

  32. Técnicas especiais: Contraste por Interferência DiferencialDIC A. C. Cassola

  33. Imagem de Fluorescência em Microscopia “Wide Field” A. C. Cassola

  34. Fluorescência A. C. Cassola

  35. Microscopia de fluorescência “wide field” A. C. Cassola

  36. Imagem de Fluorescência em “Wide Field”“Filter Cube” A. C. Cassola

  37. Imagem de Fluorescência A. C. Cassola

  38. Microscópio de epifluorescência “Wide Field” UV Filter Cube set #487902 (Exciter Filter: G 365, Beam Splitter: FT 395, Barrier Filter: LP 420). This cube is used to visualize UV-excitable fluors like DAPI. Blue Filter Cube set #487910 (Exciter Filter: BP 450-490, Beam Splitter: FT 510, Barrier Filter: BP 515-565). Fluorescein, GFP and Oregon Green can be visualized using this filter set. Green Filter Cube set #487915 (Exciter Filter: BP 546±12, Beam Splitter: FT 580,Barrier Filter: LP 590). Green-excitable fluors like rhodamine and Cy3 can be visualized using this filter set. A. C. Cassola

  39. Espectro da HBO A. C. Cassola

  40. Zeiss Axiovert 100 M A. C. Cassola

  41. Microscópio Confocal Microscópio de fluorescência a laser com iluminação puntiforme Microscópico de varredura Fatiamento óptico produz qualidade de imagem superior à da epifluorescência Resolução no eixo Z Resolução temporal reduzida. A. C. Cassola

  42. Microscópio Confocal: aplicaçoes As que demandam resoluçao espacial XYZ Investigação de colocalização de moléculas que possam ser identificadas por indicadores fluorescentes Análise da interação entre moléculas (FRET) Análise da migraçao de moléculas (FRAP) etc A. C. Cassola

  43. Microscopia confocal A. C. Cassola

  44. Princípio da Microscopia confocal A. C. Cassola

  45. A. C. Cassola

  46. Imagem multiespectral A. C. Cassola

  47. A. C. Cassola

  48. Resoluções lateral e axial A. C. Cassola

  49. Resolução e “Airy pattern” A. C. Cassola

  50. Compromissos A. C. Cassola