Rekombináns fehérjék előállítása bakteriális expressziós rendszerben

1. Rekombináns fehérjék előállítása bakteriális expressziós rendszerben

2. In vivo expressziós rendszerek • Prokarióta • E. coli: széles körben alkalmazott, egyszerűen kontrollálható, magas hozam, nem lehetséges a transzláció utáni módosítás, aktivitás elveszhet, endotoxinok • S. aureus: a termelődő fehérje a tápoldatba szekretálódik, nem magas a hozam • Eukarióta • Élesztő: kevés az endogén eredetű fehérjetermelődés, fermentáció olcsó, glikoziláció és diszulfidhidak kialakulhatnak, bonyolult kontrollálhatóság, a glikoziláció nem az emlős sejtes • Rovarsejtek /Bakulovírus/: poszttranszlációs módosítások, magas hozam, biztonságos, az aktivitás nem mindig lesz meg • Emlős sejtek: nagy mennyiségben alkalmazható, sejtek kezelése nehezebb, kis hozam • Gomba: fermentáció jól kivitelezhető, biztonságos, kis hozam, klónozó vektorok hiánya

3. E. coli expressziós rendszer • Az Escherichia coli (E. coli) • 1885: Theodor Escherich • Pálcika alakú, 2 μm hosszú és 0,5 μm átmérőjű Gram-negatív baktérium • Peritrich csillós, lehet csillótlan (atrich) • Tokja általában nincs, de lehet tokos. • Aerob, fakultatív anaerob • Könnyen és jól tenyészthető • A veszélytelen törzsek a melegvérű állatok emésztőrendszerének normális flórájához tartoznak • Főként cukorral és bizonyos aminosavakkal táplálkozik.

4. Centrális dogma Replikáció Transzkripció Transzláció DNS RNS Fehérje In Vivo fehérje expresszió: E. coli mint expressziós rendszer Mire van szükségünk? E. Coli Expresszálandó fehérjét kódoló cDNS Erről át is tudjon íródni Nagy mennyiségben keletkezzen a célfehérje Célfehérjét könnyen el tudjuk különíteni a sejt többi fehérjéjétől

5. Plazmidok • Kétszálú cirkuláris extrakromoszomális DNS, főleg bakteriális szervezetekben elterjedt. → csupasz vírusok, ma ezeket a molekulákat sem tartjuk élőlénynek. • Méretük 1-1000kbp. A sejten belül 1-1000 kópiaszámban léteznek. • A szekvenciájában lévő replikációs origónak köszönhetően a sejtben osztódva generációról generációra fennmarad. • Sejtről sejtre a konjugációnak nevezett folyamat során terjednek. • Interspecifikusterjedés! Horizontális géntranszfer • A sejt védekezik az idegen DNS terjedése ellen: enzimek ismerik fel a „betolakodó” DNS-t, és feldarabolva hatástalanítja Plazmidokgéntechnológiai felhasználása: • Meghatározott DNS darabot beleintegrálva képesek vagyunk felszaporítani (klónozó vektor) • Ha a plazmid lehetővé teszi, akkor a DNS-ről fehérjét is termelhetünk (expressziós vektor) A plazmidokata génjeik funkciója szerint szokták csoportosítani: • R-plazmidok (Rezisztencia plazmidok): antibiotikumok elleni védelmet biztosít. Laborban leggyakrabban használt plzmidokAmp, Kan, Tet, Chl. • Col-plazmidok: A többi sejtre mérgező, de a plazmidot tartalmazó sejt számára ártalmatlan anyag terelése (kolicin) • F-plazmidok: fertilitási plazmidok, pilus növesztésével, lehetővé teszi, hogy érintkező sejtek között génkicserélődés történjen. • Degradatívplazmid: új anyagcsereutat lehetővé tevő gének, így a sejt képes lesz új táplálékforráson megélni. • Virulencia plazmid: hatására a sejt patogenné válik → új táplálékforrás nyílik meg előtte!

6. Promoter Operátor régió Riboszóma kötőhely Transzlációs transzkripció klónozó starthely terminációs hely hely Expressziós vektorok Expressziós vektorok: Speciális genetikai környezet, mely lehetővé teszi, hogy a beépített DNS-ről fehérje íródjon át A konstrukció tervezésénél fontos, hogy az inszert a megfelelő leolvasási keretben épüljön be, különben a fehérje szekvenciája nem lesz megfelelő!!

7. 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ PCR Polimeráz lánc reakció: A DNS molekula egy meghatározott darabjának felszaporítására alkalmas módszer. Kihasználjuk, hogy a DNS polimerizációja nem de novo folyamat, az iniciációhozprimer szükséges! * * Mitől lesz ez a rendszer alkalmas arra, hogy a DNS egy meghatározott darabját amplifikálja? Mitől lesz ez lánc reakció? * * * * * * A 3. ciklustól kezdve a megjelenik az a DNS fragmentum, amit a reakcióhoz adott két primer határol. A következő ciklusban 8db (*-gal jelölt) ugyanilyen szekvencia szintetizálódik! Az 5. ciklusban pedig 64! A tipikus PCR reakció 30 ciklusának végeztére elméletileg 227db keletkezik! (limitálja: polimeráz mennyisége/denaturációja, dNTP) A „nemkívánatos” termékek mennyisége csak lineárisan, míg az amplifikálni kívánt termék mennyisége exponenciálisan nő!

8. PCR NdeI KpnI 5’ plazm...catatg...insz... ggtacc...plazm 3’3’ plazm...gtatac...insz... ccatgg...plazm 5’ Ligáz 5’ plazm...catatg...insz... ggtacc...plazm 3’3’ plazm...gtatac...insz... ccatgg...plazm 5’ Restrikciós endonukleázok • A sejt védekezik az idegen DNS terjedése ellen: enzimek ismerik fel a „betolakodó” DNS-t, és feldarabolva hatástalanítja → meghatározott szekvencia után következik be a hasítás. • Ragadós vagy tompa véget eredményez a hasítás. → a PCR-rel felszaporított DNS szakasz meghatározott helyre, meghatározott orientációban beépíthető! • Géntechnológiai felhasználás: • Olyan megszekvenáltplazmidokat használunk, melyekben jól meghatározott helyeken meghatározott restrikciós felismerő helyeket tartalmaznak. (multi cloning site) • A PCR reakciót olyan oligonukleotidokkal végezzük, melyek restrikciós felismerőhelyeket hordoznak → beépül a végtermékbe! Ha felismer 6bp-s szakaszt, akkor valószínűsége: 46-on, azaz 4096bp-onként fordul elő egy ilyen szekvencia. A coli genom: 4.600.000bp → ~1000 hasítóhely: meg kell védeni a saját genomot! Védelem: metilázok → a DNS metilálása meghatározott helyeken, gátolja a nukleáz felismerését, vagy a DNS kötését!

9. DNS konstrukció előállításának sémája Primerek + Templát Vektor Szekvenálás Emésztés / Felnyitás PCR reakció Agaróz gélelektroforézis Gélből izolálás Miniprepscreen Ligálás Tisztítás Emésztés Transzformálás DH5a sejtekbe Agaróz gélelektroforézis Agaróz gélelektroforézis Pozitív telepekről miniprep Tisztítás Tisztítás Telepscreen

10. Expressziós vektorok Speciális genetikai környezet, mely lehetővé teszi, hogy a beépített DNS-ről fehérje íródjon át. A nem kívánt expresszióelnyomjuk, majd a megfelelő pillanatban (megfelelő sejtszám) indukáljuk → indukálható promoterek Lacpromoter mögé helyezett gének csendesek, amíg a laktóz, vagy laktóz analóg IPTG nincs a közegben. 1) A vektorban T7 promóter talalható, amihez csak a T7 RNS polimeráz tud kapcsolodni, aminek a génje az E. coil genomba van integrálva egy LacI operátor mögé (DE3). 2) Lacrepresszor gátolja az átírást, mind a vektoron, mind a T7 polimeráz gén előtt. 3) IPTG-vel történő indukció során a represszor leválik, így lehetővé téve a T7 polimeráz termelését, ami aztán az inszert gén átírását végzi. 4) A pLysS vektorról átíródó T7 lizozim amellett, hogy a sejtek feltárását segíti a sejtfal bontása altal, kötődik, az indukció előtt kis mértékben termelődő T7 polimerázhoz, inaktiválja azt, igy növelve az indukció specifikusságát.

11. TC5b esettanulmánya • A TC5b egy 20 aminosavas minifehérje, azaz RÖVID • „Közvetlen” expresszálás esetén • konformációs problémák miatt a sejt proteázai feltehetőleg megemésztenék • Tiszítási problémák • Fúziós partnerrel történő expresszálás esetén • Ez azt jelenti, hogy egy másik fehérjével kovalens kapcsolatban lenne a TC5b – GST, MBP, TrxA • Hasítási problémák • Thrombin, EnterokinázA, Xa faktor , TEV • Aminosavakat hagynának az N- vagy a C-terminálison • Drágák(kivéve TEV) • Méretproblémák: kitermelési hatékonyság romlik • Az Ubikvitin fúziós expressziós rendszer jelent megoldást: • 76 aminosav + linker + HIS6 (11 kDa) • Ubikvitinhidroláz • Termeltethető E. coliban • Specifikus, nem igényel a hasítási hely kialakítását • Nem hagy aminosavat

12. TC5b esettanulmánya • A mi ubiquitines vektorunk, amelyet a Zerbe-éktől kaptunk: • pET-19B alapú • Kanamycin rezisztencia • Bele lett építve az ubiquitin és a dekahisztidin-tag Ebbe kell beépítenünk a célfehérjét kódoló DNS szakaszt, ahogyan a képen látható az ubiquitin és egy BamHI hely közé (előbbi nem látható)

13. TC5b esettanulmánya Tehát a megrendelendő két oligó (azaz oligonukleotid): 5’ vég: AATCTGTATATTCAGTGGTTAAAAGATGGCGGTCC 3’ vég: ACTCGGCGGTGGACGCCCA GAGCTAGGACCGCCATC Hogyan illesztjük be a vektorba? Ha megfigyeljük a klónozó szakasz ábráját, látható, hogy az ubiquitin és a TC5b között nincsen tag, vagyis az ubiquitin utolsó aminosava után a TC5b első aminosava következik vagyis az ubiquitin és a TC5b egymáshoz illesztendő vége tompa vég! Hogy csinálunk tompa véget? 1. Inszertoldalról oligorendeléssel 2. Vektoroldalról MungBeannukleázzal

14. TC5b esettanulmánya A két oligonukleotid által meghatározott DNS darabot PCR segítségével amplifikáljuk A TC5b cDNS-tBamHI restrikciós endonukleázzalemésztjók Felnyitjuk a pUBK vektort: NsiI, MungBeanendonukleáz, BamHI A cDNS-t és a vektort „össze”ligáljuk A ligátumot DH5a sejtekbe transzformáljuk A felnövő telepeket inszertspecifikusoligonukleotidokkalscreeneljük A pozitív telepeket (klónokat) elszaporítjuk, és kinyejük belőlük a pUBK-TC5b vektort Szekvenálás

15. A fehérjemunka Az expressziós vektor transzformálása BL-21 sejtekbe Egy telepről folyadékkultúra indítása Nagyexpresszió Stock készítés Táptalaj: jelöletlen v. jelölt Sejtek elszaporítása, majd indukálás Sejtek megsemmisítése Célfehérje tisztítása MS

16. Nagyexpresszió: Vektortól a kultúra indításáig • A megfelelő expressziós vektor transzformálása kompetens BL-21 sejtekbe • Egy (!) telepről kis folyadékkultúra indítása (3-5 ml • Telep =! Sejt • Monoklonalitás fontossága • A kis folyadékkultúrából indítjuk a nagyexpressziót (liter) • Táptalaj • Jelöletlen fehérjék termelésére: LB, 2YT • Összetétele ismeretlen: darált élesztő, emésztett fehérjék, só • Jelölt fehérjék termelésére: M9 minimál • Összetétele ismert: • MgSO4, CaCL2, Na2HPO4, KH2PO4, NaCl • NH4Cl, Glükóz • Antibiotikum • Nyomelemmix

17. Sejtek növesztése és indukálása 1. • Sejtek növesztése • E. Coli optimális növekedési hőmérséklete 37C • Rázatás (50-200 rpm) • Megfelelő edény • Erlenmeyer lombik vs. Fernbach flaska • Térfogati szabály: (edényméret)/5=táptalaj mennyisége • Sejtek növekedésének (szaporodásának) követése • OD600 (1OD ~10^9 baktérium) • MacFarrland (MF): 1MF=0,23 OD600 • Megfelelő denzitás elérésekor indukáljuk a sejteket • Sejtek indukálása • Megfelelő denzitás elérésekor – ökölszabály: OD600=0,8 (MF=3,2) • Indukálószer: IPTG • Nagyexpresszió indítása előtt ki kell tesztelni • Indukálószer koncentrációját (mM) • Indukálás hőmérsékletét (10-37) és időtartamát (3-24)

18. Sejtek növesztése és indukálása 2. • Nagyexpresszió vége = Indukálás vége • Lecentrifugáljuk a sejteket (10-15 perc, 3000-5000 rpm) • Meggyőződünk arról, hogy a sejtek termeltek a fehérjét: SDS-PAGE • Mivel a sejtekben van a fehérje, ezért azokat ki kell nyerni – fel kell őket tárni • Homogenizációs (extrakciós) pufferben: ionerő, pH, redukálószer, nehézfém-kelátor • Célfehérje védése • Proteáz inhibitor • A műveleteket jégen végezzük • Módszerek • 1. Enzimatikusan: • Lizozim: glikánhidroláz (muramidáz), hidrolizálja a peptidoglükánmurein komponensének 1,4b glikozidos kötéseit (N-acetil-glüköz-amin és N-acetilmuraminsav) • Streptomycin szulfát (30%): aminocsoportjai kötnek a foszfát-csoportokhoz, azaz a DNS-hez és foszfolipidekhez, ezáltal azok aggregálódnak • DNase • 2. Mechanikai: Fagyasztás, Frech pump, Ultrahangos roncsoló (szonikátor) • 3. Kémiailag: NaOH, MetOH, detergensek

19. A célfehérje izolálása • Feltárás után centrifugálással elkülönítjük a szolubilis frakciót a csapadéktól • 20 perc, 18000 rpm • Mindkét frakcióból mintát veszünk, és SDS-PAGE-t végzünk velük • Fő kérdés, hogy melyik fázisban van a célfehérje, meghatározza a későbbi tisztítási lépések folyamatát: • Szolubilis fázis: Tisztítás natív körülmények között • Csapadék fázis: A fehérje inklúziós testekbe (IBS) került, tisztítás denaturáló körülmények között, refoldálási lépés szükséges Célfehérje izolálását a sejt többi fehérjéjétől nagyban meghatározza az expressziós vektor felépítése, illetve hogy melyik fázisba „került”

20. (Gél)elektroforézis Különböző fehérjék adott pH-n más-más töltéssel rendelkeznek. Vizes oldatban, elektromos erőtér hatására vándorlásra késztethetőek. Eltérő relatív töltésük miatt különböző sebességgel mozognak, azaz elválaszthatók egymástól. Elválasztás történhet: relatív töltés, méret, izoelektromos potn alapján

21. Poliakrilamid-Gélelektroforézis • Akrilamid: katalizátor és iniciátor hatására gyökös polimerizációra képes, ezáltal nagy mólsúlyú lineáris polimer jön létre • Hidrofil, kémiailag inert és stabil • Neutrális (töltésektől mentes) • Fizikailag ellenálló • Áttetsző Megfelelő keresztkötő ágens hatására térhálós szerkezetet hozhatunk létre. A koncentráció révén a pórusméret szabályozható: molekulaszűrőt hozhatunk létre PoliAkrilmaidGélElektroforézis: Nagy felbontóképesség, szeparálás relatív töltés, méret és alak alapján

22. Poliakrilamid-Gélelektroforézis • A gél elkészítése • Akrilamid : biszakrilamid oldat – pórusméret! • Megfelelő pH-júpufferoldat • Katalizátor (Ammónium-Peroxidiszulfát) és Iniciátor (TEtraMetilEtilén-Diamin) • Az APS vizes közegben spontán bomlik, szabad gyökök keletkeznek. Ezek azonban nem képesek az akrilamid kettős kötését felhasítva elindítani annak gyökös polimerizációját. Viszont gerjeszti a TEMED-et, melyből ekkor szabad gyökök alakulnak ki – ezek indítják el a polimerizációt • Kialakítás: üvegampullák vagy két üveglap közé • A gélelektroforézis sikerét két dolog befolyásolja • Akrilamid koncentráció • pH helyes megválasztása • Fehérjék esetében a pI-nélmgasabbpH-n dolgozunk, így a fehérje negatív töltésű, az anód fele vándorol • Puffer • Állandó pH-t biztosít • Ionjai végzik az áramvezetést: A fehérjék minimálisan vesznek ebben részt – ha túl alacsony a [puffer], akkor a fehérje is részt vesz az áramvezetésben, ez elkenődött sávokat eredményez. Ha magas a [puffer], akkor viszont kicsi a fehérje mobilitása

23. Poliakrilamid-Gélelektroforézis • Pufferrendszerek • Folytonos (diszkontinuus) • Ugyanaz a puffer a gélben és a tankban • Egyszerű, de rossz a felbontása • Diszkontinuus • 2 gél • Szeparáló • Koncentráló • Alacsony [akrilamid] miatt nem érvényesül a molekulaszűrő hatás • 3 puffer – két különböző anion • A két gélben az anion egy erős sav maradéka, amelynek disszociációs foka nem függ a közeg pH-jától, azaz töltése széles pH tartományban állandó • A tank pufferben az anion egy gyenge sav savmaradéke, glicinát anion • Pufferrendszer hatása • Tankban a pH 8,3, a koncentráló (felső) gélben pH 6,5-6,8 • A koncentráló gélben a glicin ikerionos állapotban van, lecsökken a töltéssel rendelkező molekulák száma, megnöveli az elektromos ellenállást – állandó az áramerősség, megnő a térerő (Ohm-törvény) • Fehérjék vándorlása emiatt felgyorsul, amíg eléri a kloridionokban gazdag frontot, itt összetorlódnak a fehérjék • A szeparáló (alsó) gélben a pH 8,8-9,0 • a glicin töltése negítív, így megszűnik a koncentráló hatás, tehát a fehérjék fajlagos töltésük szerint vándorolnak, illetve érvényesül a gél molekulaszűrő hatása

24. Gélelektroforézis – Felhasználási területek • Natív-PAGE: Natív fehérjék elválasztása • A közeg natív, tehát megmaradhat pl. az enzimaktivitás a natív szerkezet • A gél pH-jánál alacsonyabb pI értékű fehérjék vizsgálhatóak: puffer megválasztásának fontossága! • A mozgékonyság itt önmagában nem ad információt a méretről illetve a töltésmennyiségről • SDS-PAGE: Denatruált fehérjék elválasztása molekulatömeg szerint • SDS: Nátrium-dodecil-szulfát – anionos detergens és fehérjedenaturáló szer • Izoelektromos fókuszálás: Fehérjék elválasztása izoelektromos pont szerint • Minden fehérje addig vándorol, míg a környezet pH-ja meg nem egyezik a pI értékével • pH gradienst tartalmazó gél • 2D-PAGE: Izoelektromos fókuszálás + SDS-PAGE • Agaróz gélelektroforézis: nagyobb nukleinsavak méret szerinti elválasztása • A poliakrilamid gél pórusmérete kicsi, emiatt agaróz gélt használnak • Festék: etídium-bromid, SyberGreen

25. SDS-Poliakrilamid-Gélelektroforézis • SDS-PAGE: Denatruált fehérjék elválasztása molekulatömeg szerint • SDS: Nátrium-dodecil-szulfát • anionos detergens és fehérjedenaturáló szer • Forralás hatására köt a fehérjéhez egyenes arányban az aminosavtagszámmal • Marker: Fehérjelétra • Brómfenolkék (3',3",5',5" tetrabromophenolsulfonphthalein) • CoomassieBrilliantBlue (C45H44N3NaO7S2)

26. A célfehérje izolálása • Célfehérje tisztítása két lépésben: • Sejt többi fehérjéjétől való elkülönítés • Mérésre alkalmas minta előállítása • Durva frakcionálás • Differenciál centrifugálás: Szedimentációs koefficiens • Kisózás-Besózás (ammónium-szulfát) • Dialízis • Frakcionálás szerves oldószerrel • Szekeltívdenaturáció

27. Tisztítási lehetőségek: Biológus kromatográfia • Ioncsere • Töltéssel rendelkező molekulák egyik leghatékonyabb elválasztási technikája • Oldhatatlan hordozó (mátrix) felszínéhez kovelensen töltött csoportok vannak kötve • A mátrix • Hidrofób: szubsztituált polisztirol, vízlágyításra jó, a fehérjéket többnyire kicsapja • Hidrofil: cellulóz, dextrán (Sephadex), szintetikus polimer (monoBead, TSK) • Töltött csoportok: • Ha pozitív töltésű, akkor negatívat köt: Anioncsere – Q, DEAE, QAE • Ha negatív töltésű, akkor pozitívat köt: Kationcsere – CM, SP, S • Gélszűrés • Töltet 10-300 um átmérőjű porózus, hidrofil gélszemcsékből áll • Két folyadéktér alakul ki • Gélszemcséken kívüli szabadon mozgó (gyors) • Gélszemcséken belüli korlátozottan mozgó (lassú) • A molekulák mozgása attól függ, hogy képes e bejutni diffúzóval a gélszemcse belsejébe • Reverz fázisú kromatográfia (RPC), Hidrofób kölcsönhatás kromatográfia (HIC) • Hidrofil gélek felszínénz kovalensen kötött alkilszubsztituensek • RPC: C4-C18 szubsztituenssel, szubsztitúció foka magas • HIC: C2-C8 szubsztituens, szubsztitúció foka alcsony

28. Tisztítási lehetőségek: Affinitás kromatográfia • Affinitás: • Antitest – Antigén • Enzim – Szubsztrát, Szubsztrátanalóg • Hormon – Receptor • Glutation – GST • Fém-kelát – HIS-tag • IMAC = Immobilized Metal AffinityChromatography • Agaróz gyantához kapcsolva nitirtilotriecetsav képes fémionok megkötéséreAhisztidinimidazol oldallánca deprotonált állapotban képes koordinációs kötést létesíteni fémionokkal • Fehérjék kötésére használt fémionok: Cu, Co, Ni • Foszforilált fehérjék kötésére használt fémionok: Fe, Zn, Ga

29. Tisztítási lehetőségek: IMAC • Folyamata: • Szobahőmérsékletűre „melegítjük” • 3-4 oszloptérfogatnyi dH2O-val eltávolítjuk a tárolásra használt 20% etanolt • 3-4 oszloptérfogatnyi pufferrel egyensúlyba hozzuk az oszloptöltetet • Felvisszük rá a mintánkat • a mintát előzőleg fecskendőszűrővel átszűrjük, • minél lassabban visszük fel a mintát, annál jobban járhatunk a kötődést illetően • 3-4 oszloptérfogatnyi mosó pufferrel eltávolítjuk az oszlopról a nem-specifikusan kötődő fehérjéket • 3-4 oszloptérfogatnyi eluáló pufferrel eltávolítjuk a célfehérjét • 3-4 oszloptérfogatnyi dH2O-val mossuk az oszlopot • 2-3 oszloptérfogatnyi 20% EtOH-val mossuk az oszlopot, majd a hűtőbe rakjuk Eluálás Lépcsős vs. Gradiens Imidazol vs. pH

30. Tisztítási lehetőségek: IMAC • Pufferek – Natív fehérjék tisztításához • Egyensúlyba hozás: Natív Feltáró pH8 (50mM NaH2PO4, 300 mMNaCl, 0,2g Na-azid) • Mosó puffer: pH8, 50mM NaH2PO4, 300 mMNaCl, 0,2g Na-azid, 5mM imidazol • Eluálás: eluáló puffer (50mM NaH2PO4, 300 mMNaCl, 250 mMimidazol, 0,2g Na-azid • Pufferek – Denaturált fehérjék tisztításához • Egyensúlyba hozás: 6M Gdn.HCl, 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, pH8 • Mosó puffer: 6M Gdn.HCl, 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, pH6 • Eluáló puffer: 6M Gdn.HCl, 50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, • „Profinity IMAC resin” kémiai kompatibilitása • Ajánlott, hogy a pufferben legyen 50mM NaH2PO4, és 300mM NaCl • Nikkeltelenítés: EDTA • Redukálószerek : b-merkaptoetanolmax 30mM, DTT max 5mM, TCEP 5mM • Denaturálószerek : 6M Gdn.HCl, 8M Urea, 1% SDS

31. A TC5b esettanulmánya Az expresszálódó célfehérje: His-Ubiquitin-TC5b Tapasztalatok alapján a szolubilis fázisba kerül – natív állapotban tisztítható Első tisztítási lépés: Ni-affinitás-kromatográfia Fúziós fehérje hasítása Ubiquitinhidrolázzal Második tisztítási lépés: Ni-affinitás-kromatográfia Harmadik tisztítási lépés: HPLC

32. HPLC A TC5b esettanulmánya Transzformálás – Telep – Folyadékkultúra indítása Nagyexpresszió Sejtek feltárása SDS-PAGE: HIS-UBQ-TC5b a szolubilis fázisban Ni-affinitás kromatográfia Dialízis – imidazol eltűntetése Hidrolázos (YUH) emésztés „anti-His-tag” kromatográfia HPLC MS