“Modelli di interazione tra campi EM e canali ionici cellulari”

1. Roma, 06/02/2008 “Modelli di interazione tra campi EM e canali ionici cellulari” Alessandra Paffi B. Hille’s thesis (1967) drawing of an excitable membrane showing three separate types of ion channels Na, K and leak (L), as well as the Na-K ATPase pump, a “carrier,” a serine protease modeled after acetylcholinesterase, and lipids.

2. Membrana cellulare Canale ionico I canali ionici cellulari Cellula I canali ionici sono proteine transmembranali che, tramite un meccanismo di “gating”, permettono il passaggio selettivo di specifiche specie ioniche attraverso la membrana cellulare

3. Tipologie di canali ionici Rispetto alla natura del segnale che modula il gating dei canali: Canaliligando-dipendentila cui conduttanza dipende, direttamente o indirettamente, dal legame con una specie chimica Canalivoltaggio-dipendentila cui conduttanza dipende dal potenziale di membrana

4. Permettono l’instaurarsi e la propagazione del potenziale d’azione Funzioni dei canali ionici cellulari Nel sistema nervoso… Alla base del mantenimento potenziale di resting Mediano la trasmissione sinaptica

5. Tecnica del patch-clamp (E. Neher e B. Sackmann, Premio Nobel 1991) Elettrodo di riferimento Microelettrodo di vetro riempito di soluzione salina Cellula Patch di membrana d  1 m Sigillo R  10 G Corrente di singolo canale Comportamento stocastico pA

6. Configurazioni Configurazioni • Cell-attached: • per la registrazione di correnti di singolo canale in condizioni imperturbate • Whole cell: • per la registrazione della corrente attraverso l’intera membrana cellulare • Outside-out: • per lo studio di canali attivati da recettori extracellulari • Inside-out: • per lo studio di canali a regolazione citoplasmatica

7. Sorgente di campo EM Effetti? Parametri fisiologici Campo EM interno al sistema biologico esposto Modello di rete neuronale mm Tensione di membrana DOSIMETRIA Modello di membrana MODELLISTICA Campo EM sulle singole cellule Corrente di canale m Modello di singolo canale Campo EM su strutture microscopiche Probabilità di legame Ione ligando sito recettore nm Campo EM locale su strutture microscopiche La modellistica nell’approccio integrato

8. current recording sintesi del modello Corrispondenza 1:1 Biophysical model Simulated current Il modello biofisico Patch-Clamp technique Experimental activity

9. LIMITI DI VALIDITA’ DEL MODELLO: 1) n° finito di configurazioni stabili; 2) transizioni tra stati reversibili ed istantanee. Modelli di Markov di canali ionici Evidenze sperimentali mostrano che il comportamento stocastico dei canali ionici è ben rappresentato da processi di Markov a stati finiti e tempo continui, in cui lo stato futuro dipende solo da quello attuale. n° conformazioni stabili canale n° stati automa stocastico

10. Generalità processi di Markov • In un processo di Markov X(t) lo stato futuro dipende soltanto da quello attuale. • Si dice catena di M. un processo che può occupare un numero finito o una infinità numerabile di stati. • Sia i processi che le catene di M. possono essere tempo-discreto o tempo-continuo. • Dato lo stato presente, una catena di M. è completamente definita dalle probabilità di transizione, nel caso tempo-discreto, e dai tassi di transizione, nel caso tempo-continuo. • Una catena di M. è detta omogenea se i tassi di transizione sono indipendenti dal tempo. In tal caso, le probabilità di transizione sono dette stazionarie. • Data una catena di M., resta univocamente definito il processo dei tempi di permanenza negli stati(Tdwell) che, per processi omogenei, tempo-continui, ha distribuzione esponenziale.

11. β C O α Il modello a due stati Considerando il modello più semplice, cioè quello a due soli stati: α e β sono i tassi di transizione ed hanno le dimensioni di una frequenza INTERPRETAZIONE PROBABILISTICA t +o(t) Prob(channel shuts between t e t+t | open at t) =limt0 [Prob(channel shuts at t+t | open at t)/t]

12. Caratterizzazione modello L’evoluzione dinamica del sistema è descritta da un sistema di eq. diff. ordinarie del 1° ordine con P(t) vettore delle occupanze (probabilità di occupazione di ciascuno stato al tempo t) Matrice tassi di transizione qij=limt0[Prob(state j at t+t | state i at t)/t]= limt0[Pij(t)/t]; ij qij(t, Vm, T, c ,...) tassi di transizionedipendenti da grandezze fisiche: temperatura (T), tensione di membrana (Vm),concentrazione di ligandi (c). Processo generalmente non omogeneo

13. Generalità processi di Markov • In un processo di Markov di ordine zero X(t) lo stato futuro dipende soltanto da quello attuale. • Si dice catena di M. un processo che può occupare un numero finito o una infinità numerabile di stati. • Sia i processi che le catene di M. possono essere tempo-discreto o tempo-continuo. • Una catena di M. è detta omogenea se i tassi di transizione sono indipendenti dal tempo. In tal caso, le probabilità di transizione sono dette stazionarie. • Dato lo stato presente, una catena di M. è completamente definita dalle probabilità di transizione, nel caso tempo-discreto, e dai tassi di transizione, nel caso tempo-continuo. • Data una catena di M., resta univocamente definito il processo dei tempi di permanenza negli stati(Tdwell) che, per processi omogenei, tempo-continui, ha distribuzione esponenziale.

14. Matrici di transizione TEMPO DISCRETO TEMPO CONTINUO Dato lo stato presente, la catena è completamente definita dalle probabilità di transizione pij Dato lo stato presente, la catena è completamente definita dai tassi di transizione qij La matrice dei tassi di transizione Q(t) ha per elementi i tassi qij, per ij. Gli elementi sulla diagonale principale sono tali che la somma per righe sia uguale a zero. Tale matrice ha tutti gli autovalori con parte reale non positiva ed almeno uno uguale a zero. La matrice delle probabilità di transizione (tm,tn) ha tutti elementi non negativi e la loro somma per righe è pari ad 1. Tale matrice ha un solo autovalore pari ad uno e tutti gli altri, in modulo, minori di 1.

15. Variabili input Q(t, V, T, c…) P(t) Popen(t) I(t)  Vettore occupanze Probabilità apertura Corrente ionica P0(t) numero canali Ng(Vm-Veq) Condizione iniziale conduttanza scostamento tensione di equilibrio La corrente ionica Popen(t)=ΣkPk kO (insieme stati aperti) I(t)=NgPopen(t)(Vm-Veq)

16. Generalità processi di Markov • In un processo di Markov di ordine zero X(t) lo stato futuro dipende soltanto da quello attuale. • Si dice catena di M. un processo che può occupare un numero finito o una infinità numerabile di stati. • Sia i processi che le catene di M. possono essere tempo-discreto o tempo-continuo. • Una catena di M. è detta omogenea se i tassi di transizione sono indipendenti dal tempo. In tal caso, le probabilità di transizione sono dette stazionarie. • Dato lo stato presente, una catena di M. è completamente definita dalle probabilità di transizione, nel caso tempo-discreto, e dai tassi di transizione, nel caso tempo-continuo. • Data una catena di M., resta univocamente definito il processo dei tempi di permanenza negli stati(Tdwell) che, per processi omogenei, tempo-continui, ha distribuzione esponenziale.

17. Tempi di permanenza Processo dei tempi di permanenza negli stati(Tdwell) Processo di Markov R(t)=1-F(t) F(t): distribuzione di probabilità R(t)=P(channel open between 0 and t)=P(>t) R(t+t)=P(channel open between 0 and t+t)= =P(channel open between t and t+t | open between 0 andt)P(open between 0 and t) =P(channel open between t and t+t|openin t)P(open between 0 and t) =[1- t-o(t)]R(t) Proprietà processi Markov dR(t)/dt=- (t)R(t) Per processi omogenei (=cost.) Distribuzione esponenziale F(t)=1-e-αt La distribuzione di una famiglia di stati è una somma di termini esponenziali

18. Tclosed 3 exp Sintesi dei modelli Per la sintesi dei modelli di Markov dalle registrazioni di singolo canale è necessario estrarre informazioni su: numero di stati, connettività, tassi di transizione. A tal fine si ricorre sia a tecniche tradizionali che a metodi basati sugli Hidden Markov Models (HMM), usati per registrazioni molto rumorose. Numero di stati Connettività Tassi Correlazione tra tempi di apertura; correlazione tra tempi di chiusura Legati alle costanti di tempo delle funzioni esponenziali (2 stati: inverso dei tempi medi di apertura e chiusura) Numero esponenziali fitting distribuzioni Tdwell Tecniche tradizionali Massimizzazione likelihood P(dati osservati|modello) Noto a priori Nota a priori HMM Per valutare la corrente occorre estrarre anche la conduttanza dalle registrazioni sperimentali.

19. Esempi Canali voltaggio dipendenti 5 stati: 4 chiusi 1 aperto POTASSIO (A. L. Hodgkin and A. F. Huxley, 1952.) SODIO 8 stati: 3 chiusi 4 chiusi inattivati1 aperto (A. L. Hodgkin and A. F. Huxley, 1952.)

20. Esempi Canali voltaggio dipendenti CALCIO L-TYPE 3 stati: 2 chiusi 1 aperto (Aradi & Holmes, 1999)

21. Esempi Canali ligando dipendenti CANALE SK Canali del K+ controllati dal Ca2+ a bassa conduttanza (g=4-18 pS) Siti di ricezione ioni Ca2+ Dominio di legame della Calmodulina Calmodulina: subunità proteica delegata alla ricezione degli ioni Ca2+ Subunità  canale SK

22. CaM 1 CaM 2 d g a b N-Terminal C-Terminal N-Terminal C-Terminal N-Terminal C-Terminal N-Terminal C-Terminal CaM 4 CaM 3 Esempi Canali ligando dipendenti CANALE SK • Ciascun canale SK contiene 4 proteine CaM per la ricezione di Ca2+ • Il canale è aperto quando almeno un sito del dominio N Terminal di ciascuna CaM è legato uno ione Ca2+ per ciascuna CaM: Ca2+ Ca2+ Ca2+ N- Terminal C- Terminal

23. Kopen Kopen Kopen Kopen Kopen 4a b 3a 2b 2a 3b a 4b 20 18 15 11 6 1 Kclosed Kclosed Kclosed Kclosed Kclosed 7 2 16 12 19 d 4g d 4g d 4g d 4g d 4g 3a 2b 2a 3b a 4b 8 3 17 13 2d 3g 2d 3g 2d 3g 2d 3g 2a 3b a 4b 9 4 14 3d 2g 3d 2g 3d 2g a 4b 10 5 4d g 4d g Esempi Canali ligando dipendenti CANALE SK aperti Kclosed = 100 [sec-1] Kopen = 1200 [sec-1] a = 100*106 [M-1 sec-1] b = 100 [sec-1] g = 100*106 [M-1 sec-1] d = 18 [sec-1] chiusi

24. Descrizione analitica del modello Comportamento dinamico atteso del processo: P(t): vettore delle occupanze (probabilità di occupazione di ciascuno stato) Q(t): matrice dei tassi di transizione d P(t)/dt =P(t)Q(t) I(t): corrente ionica attraverso una famiglia di canali N: numero di canali g: conduttanza singolo canale Vm: tensione di membrana Veq: tensione di equilibrio I(t)=Ng popen(t)(Vm-Veq) PROBLEMI: difficoltà computazionali nel caso non omogeneo; perdita comportamento stocastico.

25. “Una tecnica Monte Carlo è una qualsiasi tecnica che fa uso di numeri random per risolvere un problema”. “La soluzione di un problema è vista come un parametro di una ipotetica popolazione; usando una sequenza di numeri random si costruisce un campione della popolazione da cui possono essere ottenute stime statistiche del parametro”. (F. James, 1980) Soluzione numerica Monte Carlo (1/2) Popen(t)=n° open channels (t)/n° channels=(1/N)iNsi(ri,t) ri : vettore di numeri random uniformemente distribuiti tra 0 ed 1 N: numero di realizzazioni = numero di canali si : singola realizzazione del processo = segnale di gating del singolo canale

26. g(Vm-Veq) Gating signal Evaluation of dwell times in each state: Tdwell=f(Q,ran) Ichannel Vm Markov model Q(t, Vm) × Iionic= Imean+Iflu 1 Ichannel I (pA) I (A) 2 + ottenibile anche dalla soluzione analitica N t (ms) Soluzione numerica Monte Carlo (2/2) Permette di ricavare sia la corrente di singolo canale che la corrente ionica e di ottenere informazioni sia sul valor medio che sulle fluttuazioni stocastiche della corrente ionica.

27. Sorgente di campo EM Effetti? Parametri fisiologici Campo EM interno al sistema biologico esposto Modello di rete neuronale mm Tensione di membrana DOSIMETRIA Modello di membrana MODELLISTICA Campo EM sulle singole cellule Corrente di canale m dalla microdosimetria Modello di singolo canale Campo EM su strutture microscopiche Probabilità di legame Ione ligando sito recettore nm Campo EM locale su strutture microscopiche Il campo EM nei modelli

28. - - + V + + - - EM + + - - + + - - + + - - + + - - Campo EM + + - - + + - - + + - - + + - - + + - - + + - K + K + + Na + Na + - + - + - + - + Ca ++ - Ca ++ + - + - Outside Inside + - V fis Vm=Vfis+VEM Calcolato attraverso tecniche di microdosimetria qij=f(Vm) Coefficienti di transizione del modello di Markov Accoppiamento con il campo EM Canali voltaggio dipendenti

29. Valutazione degli effetti Procedura valida sia per sistemi reali che per modelli, cioè per outputs simulati o registrati Inputs outputs osservabile Sistema unexp Elab. EFFETTO confronto Significativo? Sistema exp Elab. outputs osservabile Campo EM

30. Tclosed Topen Tclosed Topen Output: corrente singolo canale CALCIUM L-Type channel Simulated Inward current Recorded

31. Output: corrente ionica ICarec(t) ICasim(t) Ca recorded current Unexposed Ca simulated current Unexposed Mean I: 0.16 pA Mean I: 0.15 pA La corrente ionica, sia simulata che registrata, mostra delle fluttuazioni attorno al valor medio dovute al gating stocastico dei singoli canali.

32. Scelta dell’osservabile Come quantificare l’effetto di un campo EM esogeno? Popen(t) • Possibili osservabili: • Corrente singolo canale: • Probabilità di apertura; • distribuzione ampiezza; • tempi medi di apertura e chiusura; • spettri di densità di potenza; • cross-correlazione corrente-segnale EM in ingresso. • Corrente ionica: • Medie statistiche (I, II ordine); • spettri di densità di potenza; • cross-correlazione corrente-segnale EM in ingresso. VEM(t) sinusoidale

33. Corrente ionica Momenti statistici • Momenti del I ordine: • Media temporale della corrente; Non permettono un legame diretto tra l’effetto e la tipologia del segnale • Differenza quadratica media (md2) (dominio del tempo); • Momenti del II ordine: • Densità spettrale di potenza (dominio frequenza). N=36000 ICasim(t) N=150 ICasim(t) EM field: fEM:50 Hz, VEM: 1 mV. EM field: fEM:50 Hz, VEM: 1 mV. Solo per elevati valori di N (numero di canali), l’md2 evidenzia la presenza di oscillazioni legate alla presenza del segnale EM…

34. 50 Hz 50 Hz Corrente ionica Stime spettrali Ca simulated current Exposed: fEM:50 Hz, VEM: 1 mV. Ca recorded current Exposed: fEM: 50 Hz, B: 125 µT. N=150 N=150 ICarec(t) ICasim(t) Le densità spettrali di potenza delle correnti registata e simulata evidenziano la presenza di una componente alla stessa frequenza del segnale EM applicato… … ma sono affette da elevate fluttuazioni nelle componenti spettrali

35. Corrente singolo canale Distribuzione ampiezza Tracce registrate Calcio L-type Popen = 0.45 EMF: 900 MHz, SAR: 1 W/kg Popen= 0.56

36. Corrente singolo canale Distribuzione dwell-times Tracce registrate Calcio L-type Fitted by 3 exp curves (time constants: 1,2, 3) EMF: 50 Hz, 125 T Durante l’esposizione si osserva un aumento dei tempi di apertura ed una diminuzione dei tempi di chiusura. Effetto globale non correlato alla tipologia del segnale

37. Corrente singolo canale Stime spettrali Confronto spettri correnti Ca L-type simulate in condizioni fisiologiche e di sposizione Segnale sinusoidale L’osservabile scelto non rivela effetti dell’esposizione sulle tracce simulate di 75 sec. Una buona stima spettrale richiede tracce molto lunghe.

38. Corrente singolo canale Cross-correlazione Corrente simulata Ca L-type Segnale sinusoidale La cross-correlazione permette di rilevare in uscita un’informazione relativa al segnale EM in ingresso, anche su poche tracce di 75 sec.

39. Corrente singolo canale Cross-correlazione Segnale (f=60 kHz) modulato in ampiezza con un treno di impulsi rettangolari (fm=125 Hz; duty cycle= 50%) Corrente simulata Ca L-type

40. Patch-Clamp technique current recording OSSERVABILE Markov Models OSSERVABILE Validazione sperimentale

41. Sorgente di campo EM Effetti? Parametri fisiologici Campo EM interno al sistema biologico esposto Modello di rete neuronale Studio della dinamica delprocesso di adsorbimento/desorbimento di un ligando messaggero con i siti proteici recettori posti sulla superficie della membrana cellulare, in condizioni di esposizione EM esogena. mm Tensione di membrana DOSIMETRIA Modello di membrana MODELLISTICA Campo EM sulle singole cellule Corrente di canale m Modello di singolo canale Campo EM su strutture microscopiche • APPROCCI: • Modelli microscopici classici • Modelli microscopici quantistici • Dinamica molecolare Probabilità di legame Ione ligando sito recettore nm Campo EM locale su strutture microscopiche Verso il microscopico

42. Campo EM Probabilità legame ligando-sito recettore EM  K+ EM  K- K- K+ Coefficienti di transizione del modello di Markov Accoppiamento con il campo EM Canali ligando dipendenti • dinamica del processo di adsorbimento/desorbimento ligando-sito recettore attraverso: • modelli microscopici • dinamica molecolare

43. Campo EM Studio del voltage sensor e di una porzione di membrana attraverso la dinamica molecolare qijEM Coefficienti di transizione del modello di Markov in condizioni di esposizione Accoppiamento con il campo EM Canali voltaggio dipendenti Rappresentazione a livello più microscopico… Possibile alterazione nella distribuzione di cariche superficiali e nella sensibilità del voltage sensor

44. Campo EM gEM Conduttanza singolo canale in condizioni di esposizione Accoppiamento con il campo EM Sia per canali ligando che voltaggio dipendenti Rappresentazione a livello microscopico della conduttanza Possibili alterazioni nella conduttanza di singolo canale • Studio del moto dello ione nel poro attraverso: • modelli microscopici • dinamica molecolare

45. Bibliografia • F. Apollonio, M. Liberti, G. D'Inzeo, and L. Tarricone, "Integrated Models for the Analysis of Biological Effects of EM Fields Used for Mobile Communications," IEEE Transactions on Microwave Theory and Techniques, pp. 2082-2094, November 2000. • E. Neher and B. Sakman, Single channel recording, 2nd ed. New York and London: Plenum Press, 1998. • L. Venkataramanan and F. J. Sigworth, "Applying Hidden Markov Models Analysis of Single Ion Channel Activity," Biophysical Journal, vol. 82, April 2002. • F. James, "Monte Carlo theory and practice," Report on Progress in Physics, vol. 43, pp. 1145-1189, 1980. • A. Papoulis, S. U. Pillai, “Probability, Random Variables and Stochastic Processes”, McGraw-Hill, 2002. • A. L. Hodgkin, A. F. Huxley, “A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve”, Journal of Physiology, 117 pp. 500-344, 1952. • ARADI, I. & HOLMES, W. R. (1999), “Role of multiple calcium and calcium-dependent conductances in regulation of hippocampal dentate granule cell excitability”, J.Comput Neurosci., vol. 6, pp. 215-35.