Zastosowania mAb

1. Zastosowania mAb • Badania naukowe(wykrywanie różnych związków, obrazowanie, lokalizacja, oczyszczanie, określanie stężenia etc.) (ELISA, RIA, Western blotting, cytometria przepływowa, barwienie immunocytochemiczne) • Biotechnologia (abzymy,chromatografia powinowactwa) • Diagnostyka • Terapie

2. Światowy rynek przeciwciał monoklonalnych stosowanych w diagnostyce i terapiach 2004 –11 200 000 000$ i planowano: 2010 – 26 000 000 000 $ W rzeczywistości: 2007 – 27 000 000 000 $ 2008 – 33 000 000 000 $ 2010 > 40 000 000 000$

3. Nazwa handlowa Nazwa producenta Cel OKT3 Muromonab CD3 Tysabri Natalizumab VLA4 (ł. alfa) Rituxan Rituximab CD20 Simulect Basiliximab IL2Ra Zenapax Daclizumab IL2Ra Remicade Infliximab TNF Humira Adalimumab TNF Synagis Palivizumab wirus RSV Herceptin Trastuzumab HER2 EGFR (HER1) Erbitux Cetuximab Xolair Omalizumab IgE Avastin Bevacizumab VEGF

7. Kto i kiedy po raz pierwszy zastosował w terapii przeciwciała?? Nie były to jeszcze przeciwciała monoklonalne, a odkrywca terapii nie wiedział, że to co działa to są przeciwciała!

8. Emil von Behring 1854 - 1917 Pierwsza Nagroda Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny – 1901 "for his work on serum therapy, especially its application against diphtheria, by which he has opened a new road in the domain of medical science and thereby placed in the hands of the physician a victorious weapon against illness and deaths" Ciekawostka: Emil von Behring urodził się w miejscowości Hansdorf – obecnie Ławice w woj. warmińsko-mazurskim.

9. Shibasaburo Kitasato pracował ręka w rękę z Behringiem, ale Nobla nie dostał

10. Emil von Behring pracował nad stosowaniem surowic przeciw tężcowi i przeciw błonicy • Wprowadził pojęcie „antytoksyna” • 1893 – pierwsze próby leczenia błonicy u ludzi uwieńczone sukcesem http://history.nih.gov/exhibits/history/assets/images/antitoxin_lg.jpg&imgrefurl

11. Struktura IgG1 CDR = regiony hiperzmienne albo regiony determinujące dopasowanie

12. http://www.spaltudaq.com/files/JPEG%20of%20Antibody.JPG

13. Fragmenty zmienne VL i VC(niebieskie) przeciwciała monoklonalnego anty-lizozym oddziałujące z antygenem (lizozym – zielony)

15. Oblicza się, że może istnieć1011różnych swoistości przeciwciał • Podstawowe źródła zmienności to: • Somatyczna rekombinacja • Składanie łańcuchów ciężkich i lekkich • Dojrzewanie przeciwciał – somatyczne hipermutacje Z czego wynika zmienność przeciwciał? Susumu Tonegawa (lata 80) – Nagroda Nobla (1987) za odkrycie genetycznych podstaw różnorodności przeciwciał

16. Budowa genów kodujących łańcuchy lekkie i ciężkie immunoglobulin człowieka

17. Rekombinacja VDJ segmentów łańcucha ciężkiego RAG1 i RAG2 są zaangażowane w ten proces RAG (ang. Recombination Activating Genes)

18. V D J CDR1 CDR2 CDR3 Fragment zmienny łańcucha ciężkiego Region CDR3 charakteryzuje się największą zmiennością

19. Podczas procesu rekombinacji fragmentów genów kodujących łańcuchy immunoglobulin dochodzi do utraty części materiału genetycznego. Genom dojrzałej komórki B jest uboższy o fragmenty DNA od innych komórek organizmu. Analogiczny mechanizm jest znany jedynie przy kombinatorycznym składaniu genów kodujących łańcuchy receptora limfocytów T (TCR)

20. Różnicowanie komórek B obejmujące rearanżację genów Ig zachodzi w szpiku kostnym. Szpik opuszczają komórki B charakteryzujące się ekspresją IgM na powierzchni komórek (IgM stanowi podstawową część BCR) opuszcza szpik

21. Dalsze różnicowanie komórek B zachodzi we wtórnych tkankach limfatycznych • (śledziona, węzły chłonne) • Wymaga interakcji komórek B z aktywowanymi limfocytami Th2 • Dwa procesy zachodzące podczas różnicowania to: • dojrzewanie przeciwciał czyli • zwiększanie ich powinowactwa w • wyniku somatycznych hipermutacji • zmiana klasy przeciwciała • (class switch, isotype switch)

22. C.A. Janeway i wsp. „Immunobiology”

23. Przełączanie klas Cytokiny wpływają na przełączanie klas. Na przykład u myszy:

24. Immunoglobuliny różnych klas różnią się od siebie aktywnościami Klasy Ig mysich (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3) nie odpowiadają klasom Ig człowieka. • Wszystkie mysie IgG przechodzą przez łożysko. • Wszystkie mysie IgG z wyjątkiem IgG1 aktywują dopełniacz. • Wszystkie mysie IgG z wyjątkiem IgG3 wiążą się z FcRg.

25. Jakie znaczenie ma to, że przeciwciała zbudowane są z łańcuchów lekkich i ciężkich? Czy można sobie wyobrazić przeciwciała złożone z jednego typu łańcuchów?

26. Przeciwciało ludzkie Przeciwciało wielbłąda Pierwsze doniesienia w 1997 roku nanociało (nanobody) hit biotechnologii

27. CO TO SĄ PRZECIWCIAŁA POLIKLONALNE? CO TO SĄ PRZECIWCIAŁA MONOKLONALNE? CZYM SIĘ RÓŻNIĄ?

30. Przeciwciała poliklonalne to po prostu mieszanina przeciwciał monoklonalnych

32. Co mogą rozróżniać mAb, czego nie mogą rozróżniać przeciwciała poliklonalne Przykłady: • Dojrzałą formę białka od probiałka • Zmutowaną formę białka • Specyficzne potranslacyjne modyfikacje (fosforylacja,glikozylacja itp.) dotyczące konkretnego białka

33. Przykład: immunoprecypitacja chromatyny (z pracy dr Anety Kaszy) anty-Elk-1 IgG anty-P-Elk-1 1 2 3 4 1 2 3 4 Badano promotor genu PAI-1. Komórki poddawano działaniu różnych czynników. Stosując przeciwciała anty-Elk-1 stwierdzono, że niezależnie od stymulacji tyle samo czynnika transkrypcyjnego jest związane z promotorem. Stosując przeciwciała rozpoznające ufosforylowany epitop Elk-1 stwierdzono, że czynnik dodany do próbki komórek 3 powoduje fosforylację Elk-1.

34. 3 całkiem różne białka ale posiadające ten sam epitop mogą być rozpoznawane przez to samo mAb Specyficzność mAb mAb są specyficzne w stosunku do epitopu Jeśli dany epitop jest unikalny – tzn. występuje tylko w danym antygenie, to mAb będąc specyficznymi w stosunku do danego epitopu są równocześnie specyficzne w stosunku do antygenu Jeśli epitop nie jest unikalny, np. jest charakterystyczny dla rodziny białek, wtedy mAb nie jest specyficzne w stosunku do antygenu

35. Przeciwciała monoklonalne mogą być w pełni scharakteryzowane (sekwencja aminokwasowa, struktura). Są molekułami zdefiniowanymi. Przeciwciała poliklonalne, jako mieszanina różnych białek, nie dają się w pełni scharakteryzować.

36. PRZECIWCIAŁA MONOKLONALNE ZALETYWADY Specyficzne Ograniczona -epitop specyficzność -białko? -białko WysoceRóżnorodnośćpod zdefiniowanewzględem cech fizykochemicznych i biologicznych Niższa czułość w niektórych testach

37. Jak zrobić mAb?

39. Cesar Milstein i Georges J. F. Köhler W 1975 opracowali metodykę uzyskiwania przeciwciał monoklonalnych W 1984 roku – Nagroda Nobla “for theories concerning the specificity in development and control of the immune system and the discovery of the principle for production of monoclonal antibodies”. Niels K. Jerne – również uhonorowany (za teorię sieci immunologicznych)

41. Procedura uzyskiwania przeciwciał monoklonalnych Immunizacja zwierzęcia wybranym antygenem Izolacja śledziony i uzyskanie splenocytów immunizowanego zwierzęcia Fuzja splenocytów z komórkami szpiczaka (komórkami nadającymi uzyskanym hybrydom cechę nieśmiertelności) Selekcja – zniszczenie wszystkich komórek oprócz komórek hybrydoma Testowanie – wybranie tych hodowli hybrydoma, które produkują pożądane przeciwciała Klonowanie, testowanie, subklonowanie, testowanie – uzyskanie pojedynczych klonów produkujących pożądane przeciwciała Namnażanie wybranych klonów Izolacja przeciwciał z pożywki hodowlanej lub wysięku otrzewnowego myszy

42. JAKIE POPULACJE KOMÓREK MOŻNA ZNALEŹĆ PO FUZJI: • komórki szpiczaka, które nie uległy fuzji • komórki B, które nie uległy fuzji • komórki hybrydowe: • „złe” • „dobre” - k. szpiczaka x komórka B • „złe” to np. 2 k. szpiczaka x komórka B • k. szpiczaka x 2 komórki B • k. szpiczaka x k. szpiczaka • komórka B x limfocyt T itd. • „dobre” komórki hybrydoma stanowią zaledwie 10- 4powstałych hybryd

43. JAKIE CECHY POWINNA POSIADAĆ LINIA SZPICZAKA UŻYTA DO FUZJI ? • nie powinna produkować własnych Ig (ani ciężkiego, ani lekkiego łańcucha) • powinna mieć defekt enzymatyczny pozwalający na selekcję komórek hybrydoma • powinna łatwo ulegać fuzji a w wyniku fuzji powinny powstawać komórki stabilne, o dużej żywotności i stosunkowo szybko dzielące się • powinna „pozwalać” na wydajną syntezę mAb

44. SELEKCJA • Po to, aby „dobre” komórki hybrydoma mogły żyć i namnażać się – komórki szpiczaka muszą zginąć!!! • Do fuzji używa się komórek szpiczaka z defektem genetycznym w syntezie nukleotydów. • Istniejądwa szlaki syntezy nukleotydów: główny i poboczny (ratunkowy; ang. salvage pathway)

45. Szlak główny: • substraty do produkcji pirymidyn: • wodorowęglan, asparaginian, glutamina • substraty do produkcji puryn: wodorowęglan, asparaginian, • glutamina, glicyna, mrówczan (z formylotetrahydrofolianu)

46. orotydynofosforan

47. REZERWOWE SZLAKI SYNTEZY NUKLEOTYDÓW PURYNOWYCH 5-fosforybozylo-1-pirofosforan = PRPP fosforybozylotransferazaadeninowa  adenina + PRPP  AMP + PPi fosforybozylotransferaza hipoksantynowa  hipoksantyna + PRPPIMP + PPi guanina + PRPP GMP + PPi hypoxanthine phosphoribosyltransferase (HPRT), (HGPRT)

48. REZERWOWY SZLAK SYNTEZY dTMP kinaza tymidynowa deoksytymidyna +ATP dTMP + ADP

49. Najczęściej stosowane do fuzji szpiczaki mają defekt w genie HPRT. Komórki bez HPRT (szpiczak) nie wykorzystają substratów szlaku pobocznego i zginą Komórki z aktywnym HPRT (hybrydoma) wykorzystają substraty szlaku pobocznego i przeżyją

50. Na czym polega hamowanie szlaku głównego przez aminopterynę Aminopteryna jest inhibitorem kompetycyjnym reduktazy dihydrofolianowej N10 - formylotetrahydrofolian – uczestniczy w syntezie puryn N5, N10 - metylenotetrahydrofolian uczestniczy w syntezie TMP.