1 / 47

第一部分 工具酶与基因工程 一．限制性核酸内切酶 1 ．限制性核酸内切酶的发现 2 ． I 类和 III 类限制和修饰酶的基本特征 3 ． II 类限制和修饰酶的基本特征 4 ．甲基化酶的基本特征

第一部分 工具酶与基因工程 一．限制性核酸内切酶 1 ．限制性核酸内切酶的发现 2 ． I 类和 III 类限制和修饰酶的基本特征 3 ． II 类限制和修饰酶的基本特征 4 ．甲基化酶的基本特征 二 ．其它工具酶 1 ． DNA 连接酶 2 ．聚合酶 3 ．末端脱氧核苷酰转移酶 (TdT) 4. SI 核酸酶 5 ． Bal31 核酸酶 6 ．碱性磷酸单脂酶.

lynne
Download Presentation

第一部分 工具酶与基因工程 一．限制性核酸内切酶 1 ．限制性核酸内切酶的发现 2 ． I 类和 III 类限制和修饰酶的基本特征 3 ． II 类限制和修饰酶的基本特征 4 ．甲基化酶的基本特征

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. 第一部分工具酶与基因工程 一．限制性核酸内切酶 1．限制性核酸内切酶的发现2．I类和III类限制和修饰酶的基本特征3．II类限制和修饰酶的基本特征4．甲基化酶的基本特征 二．其它工具酶 1． DNA连接酶 2．聚合酶 3．末端脱氧核苷酰转移酶(TdT) 4. SI核酸酶 5．Bal31核酸酶 6．碱性磷酸单脂酶

  2. 限制性内切酶 (Restriction Endonuclease)* 存在于任何一种原核细菌中.* 在特异位点上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性片段.* 各种生物呈现特征性的限制性内切酶切图谱.* 在生物分类,基因定位,基因重组,疾病诊断,刑事侦察领域极为重要. 一．限制性内切酶的发现：(宿主细胞的限制和修饰作用) 宿主细胞的限制和修饰作用： 两种不同来源的入-噬菌体 入K；入B，能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（ K株 ，B 株 ）。 当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，感染下降数千倍。一但 入K 噬菌体在 B 株成功，由 B 株繁殖出 入K 后代，能感染 B 株, 不能感染原来 K株.

  3. 宿主细胞的限制和修饰作用； 1．两种不同来源的入-噬菌体 （ 入- K ，入-B ）。 2．能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（ K株 ，B 株 ）。 3．当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时， （ 入K-B ，入B-K ）感染下降数千倍。 4．一但 入K 噬菌体在 B 株成功，由 B 株繁殖出 入-K 后代，能感染 B 株, 不能再感染原来 K株. 称为：宿主细胞的限制和修饰作用 1

  4. 二．限制和修饰作用的分子机制 1．大肠杆菌宿主细胞 K株，B 株 ，有各自的限制和修饰系统。 1）它们均有三个连续的基因位点控制，hsdR; hsdM; hsdS. 2）hsdR编码限制性核酸内切酶---识别DNA分子特定位点，将双链DNA切断。（DNA分子转化细胞：受体细胞去掉hsdR基因位点） 3）hsdM编码产物是DNA甲基化酶---催化DNA分子特定位点的碱基甲基化反应。 4）hsdS表达产物的功能是---协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，识别特殊的作用位点。

  5. 2.入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞 K株，B株 中， 1）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA和噬菌体DNA 特异性保护. 2）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点。------（修饰） 3．当外来DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解 ----------（限制） 4. 由于降解不完全，外来少数DNA分子在宿主细胞中繁殖过程 中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。 5．但丧失在原宿主细胞中的存活能力，因为接受了新宿主菌甲基化修饰的同时丧失了原宿主菌修饰的标记(一但 入-K 噬菌体在 B 株成功，由 B 株繁殖出 入-K 后代，能感染 B 株, 不能感染原来 K株.)

  6. 6．细菌利用限制和修饰系统来区分自身DNA与外来DNA。C株不能产生限制性内切酶，其它来源入- 噬菌体可以感染C株，而在 C株繁殖入- 噬菌体则在 K株和 B 株 受到严格的限制作用 三 ．限制性内切酶的分类：（三大类） I． I类， II类, III类. 2． I类，III类为限制---修饰酶。 限制性内切活性和甲基化活性，都作为亚基的功能 单位包含在 同一酶分子中。 3 ． II类限制性内切酶与甲基化酶是分离的，切割位点 专 一，适合于DNA重组。

  7. 四．原核细胞中限制和修饰系统 四．原核细胞中限制和修饰系统 I类酶 II类酶 III类酶  酶分子 三亚基双功能 内切酶与甲基化酶分离 二亚基双 能 识别位点 二分非对称序列 4-6bp序列，回文结构 5-7bp非对称序列 切割位点 距识别位点1000bp 在识别位点中或靠识别位点 在识别位点 下游24-26bp 限制性反应 互斥 分开反应 同时竟争 与甲基化反应 限制作用 需要ATP 需要 需要 不需要

  8. 五．I类酶，III类酶限制-修饰酶基本特怔 1）I类酶，EcoK，EcoB。 （1）异源多聚体，亚基R.M.S分别具有限制,修饰酶的作用，特 异性位点识别活性。 （2）I类酶与 DNA识别位点结合依赖亚基 M与辅助因子S—腺苷甲硫氨酸(SAM)相互作用。 （3）S—腺苷甲硫氨酸(SAM)通过变构作用使酶处于活性状态，酶与 DNA识别位点结合后，根据甲基化状态发挥相应酶的活性，或限制, 或限修饰，或不限制不限修饰

  9. 2）III类限制修饰酶基本特怔 （1）亚基R，MS亚基组成。MS亚基具有识别和甲基化修饰双重作用. （2）修饰与限制取决于两亚基之间的竟争。 （3）切割位点无特异性，只与识别位点的距离有关 MboII 识别 5’-AAGA- 3’ 切割位点 5’-GAAGANNNNNNNN/N-3’ 3’-CTTCTNNNNNNN/NN-5’

  10. 3）II类限制修饰酶基本特怔 （1）命名规则： 生物体属名的第一大写字母和种名前两个小写构成基本名称 基本名称 + 菌株名的字母 + 罗马字母（发现顺序） Hid III Haemophilus infuenzae d株中的第三个酶 EcoR I 基因位于Escherichia coli 抗药性R质粒上 E co R I 细菌属名 细菌种名种 菌株类型 有几种限制酶

  11. （2）特点 A．识别序列 – 4，5 或 6个碱基对， EcoR I 识别 5’-G/AATTC- 3’ 序列 3’-CTTAA/G- 5’ B．180度旋转对称回文结构，对称轴在第三，四碱基之间。 C．任何一个DNA分子，每9对碱基出现一个II类酶切口。

  12. （3） 切割方式 A．以酶切特点来分 同位酶：识别相同序列切点不同。 同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。 同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。 B．以切出片段末端性质不同可分，粘性末端和平末端。 粘性末端：（Cohesive Ends）两个突出末端可退火互补—— DNA是分子重组的基础

  13. 限制内切酶切出的三种断口

  14. 六．甲基化酶的基本特征： 1)Ⅱ类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴， a)限制性内切酶，甲基化酶的识别位点相同，序列内使碱基甲基化，封闭酶切口。 b)甲基化酶封闭一个限制性内切酶切口同时产生另一种酶切口。

  15. c) DNA腺嘌呤甲基化酶 Darn DNA胞嘧啶甲基化酶 Dcm

  16. 七．酶切图谱示意图

  17. 1。 一圈表示一种酶。 2．单切口酶在里圈，越多切口酶越在外面。 3．大写英文字母表示片段（ A，B，C… A>B ）。 4．两种片段同样大小 （ A1 A2 A3… E1 E2 E3…）。几次实验后，大小不一 致以 虚线表示不肯定。

  18. 八．DNA切接反应的影响因素 1．限制性内切酶的切割反应 10-50mmol/L Tris-HCl (PH7.5), 10mmol/L MgCl2, 1mmol/L DTT (二硫苏糖醇) 只是盐浓度不同，分低盐，中盐，高盐组, 1）需两种酶切同一分子，酶对盐浓度相同，可同时反应。 2）需两种酶切同一分子，酶对盐浓度要求差别不大，中，高 盐，可同时反应。利于酶较贵重的盐浓度缓冲液。

  19. 3）两种酶切同一分子，酶对盐浓度要求差别大，低，高盐， 不可 同时反应。 a) 低盐组先切，加热灭活后，补加盐浓度再切。 b) 沉淀后重新加入另一种盐浓度缓冲液 c）两种酶不能同时反应，有先有后。 图3-16

  20. 2．酶量 标准反应37度反应1小时完全水解1微克所需的酶量。 0.1—1.0微克DNA 5微升 10倍缓冲液 2微升 酶 1微升（10倍过量） 无菌水 12微升 总体积 20微升 酶加入量不超过总体积十分之一.

  21. 九．酶切位点的确定 line DNA W=N+1 ccc DNA W=N

  22. 1.片段大小2450 line DNA W=N+1 ccc DNA W=N 2.两单酶切成三个片段,说明各有两个切点 ------p------- p--------- 750 500 1200 3 .Pst1, 1200, 750不见, 说明: (1) 另外两个酶的切点在其中 ---x-----p------p---x------ Xbo1 500 (2) 两个Pst1酶的切点相距500 500 ---1200--- 4. 1200---300+900(被Xbo1) ---x-----p------p--- x----- 300 900 Pst1距Xbo1为300 --750---- 5. 750—150+600 ----x------p-----p---x----- 150 600 Pst1距Xbo1为600 -------1400------- 6. 1400—600+500+300 ---x------p------p---x----- 600 500 300 -------------2450------------- 7. 2450-150+600+500+300+900 ---x------ p------ p----x----- 150 600 500 300 900

  23. 基因重组的其它工具酶 1． DNA连接酶 催化的基本反应形式： 图3-11 DNA双链分子上相邻 3’ 羟基和 5’ 磷酸集团共价结合， 形成 3’-5’ 磷酸二酯键， 使原来断开的缺口重新连接起来。

  24. （1）T4 DNA连接酶 由 T4噬菌体基因编码，分子量60KD。 基本活性: 图3-12 1）修复双链DNA上单链缺口 2）连接RNA-DNA杂交双链上DNA链缺口 3）连接完全断开两个平头双链DNA分子。

  25. 修复双链 DNA上 单链缺口， 连接 RNA-DNA杂交双链上 DNA链缺口， 连接完全断开两个平头 双链DNA分子。

  26. 2．聚合酶 DNA聚合酶活性 3-13 1）5’---3’聚合酶活性 2）3’---5’外切酶活性 3）5’---3’外切酶活性 4）核酸内切酶活性

  27. Klenow酶 1）5’---3’聚合酶活性 2）3’---5’外切酶活性 作用： 1）修复限制性内切酶造成3凹端，成为平末端。 2）用同位素对DNA标记。 3）催化第二链合成 4）测定DNA序列

  28. 3．末端脱氧核苷酰转移酶(TdT) 图3-14 • 1） 适合于带有3’游离羟基的双链分子。 • 2) DNA双链3’端突出时， • TdT将脱氧核苷酸聚合在二条链的3’端。 • 作用：TdT在人工粘性末端的构建极为有用。

  29. 4. SI核酸酶 1）降解单链DNA或RNA 2）反应方式为外切和内切 3）酶量大时降解双链核酸 作用：切平突出单链末端, 和发卡结构中环状。制作SI图谱

  30. 5．Bal31核酸酶 图3-15 1）3’端外切酶活性 2）5’端外切和内切活性。 作用： 1）从双链DNA两端连续降解 2）单链DNA外切和内切 3）超螺旋结构的线性化 4） 在分子克隆中可控制性截短DNA分子

  31. 6．碱性磷酸单脂酶 BAP细菌的碱性磷酸单脂酶， CIP牛小肠的碱性磷酸单脂酶 作用： 1）催化核苷酸性5’端除磷反应。 2）重组DNA中用于载体的5’末端除磷操作以提高重组效率。 3）用于外源DNA片段5’端除磷防止外源片段之间连接。

  32. 7．T4 DNA聚合酶 1）5’--3’聚合酶活性 2）3’---5’外切酶活性 3）5’---3’外切酶活性生成平头分子。 作用：用于修平非平头以及 由限制性内切酶水解产生3’突出末端。

More Related