Review: The real-time polymerase chain reaction

1. Faculdade de Ciências Farmacêuticas- Universidade de São Paulo Biologia Molecular Aplicada as Análises Clínicas Review:The real-time polymerase chain reaction Kubista et al., Molecular Aspects of Medicine 27 (2006) 95–125. Daniela Nunes Juliano Bertinato Luciene Lima Clóvis Paniz

2. Avaliação da expressão gênica

3. Tipos de primers • Vantagens: • se cDNA for clonado; • Mais eficiente e menos dependente da temperatura • Desvantagens: • se RNAm estiver degradado, a transcrição pode não alcançar a sequencia alvo da PCR. • Viés para ampliconlocalizado próximo a 3’ terminal do RNAm • Não transcreve RNAm sem cauda poliA – genes de histonas na maioria dos eucariotos e na maioria dos procariotos

4. Tipos de primers • Vantagens: • Para amostras degradadas , procariotos e RNAr é a melhor escolha • Copiam todos os tipos RNAs • Nanômeros se ligam mais fortemente ao RNA e são melhores para altas temperaturas • Desvantagem: • rendimento depende da conformação do RNAm - conformação primária.

5. Tipos de primers • Necessita de temperaturas elevadas- regiões mais acessíveis; • Vantagem: • Para poucas quantidades de RNA. • Desvantagem: • Dependente da sequencia – dobramento do RNA • Proteínas de ligação: amostra sem purificação • Desenhando um primer específico o rendimento pode não ser tão bom

6. Problemas na RT PCR • One-step : menos sensível mas menos contaminação cruzada • Two-step • Existem diversos tipos de transcriptases que se diferem no tamanho e na T°C • Contaminação com DNA genômico • Solução: usar o No-RTcontrol: amostra normal sem a enzima transcriptase

7. Expressão gênica relativa • Normalização: compensar diferenças nas amostras • Procedimentos de normalização baseavam-se em métodos físicos: volume , massa, tamanho e n° de céls. • Heterogeneidade das amostras: Normalização com: • Add de RNA padrão ou, • Avaliação de gene de referência • Cada tecido: perfil diferente

8. Painel de genes de referência

9. Painel de genes de referência

10. Software

13. Cálculo da expressão: • Correção para propagação de erros em amostras independentes deve ser aplicado: • A fórmula delta-Cttransformaosvalores de Ct emquantidadesrelativas de expressão: valor maior de expressão é igual a 1 Expressão= 2-ΔCT onde: ΔCT = CT gene de interesse - CT gene de referência

14. Exemplo: Amostra 1 Média CT gene ABCG2: 29,2028551101684 Média CT gene GAPDH: 23,5415296554565 Cálculo: Expressão= 2-(29,2028551101684-23,5415296554565) Expressão= 0,0145200460052491

15. Quando usar 2-ΔΔCT? MÉTODO COMPARATIVO: A pergunta é: QUANTAS VEZES A EXPRESSÃO GÊNICA DE UM DETERMINADO GENE , NUMA DETERMINADA CONDIÇÃO É DIFERENTE DE OUTRA CONDIÇÃO? • Exemplo 1: culturacelular- céltratada e nãotratada 2-(Ct,Target - Ct,endog)Time x - (Ct,Target -Ct,endog)Time 0 • Exemplo 2: célula HPV+ tratada versus HPV-tratada 2-(Ct,Target - Ct,endog) HPV+ - (Ct,Target -Ct,endog) HPV- LIVAK, K.J.; SCHIMITTGEN, T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods, v25, n.4, p.402-8, 2001.