El Factor Inducible por Hipoxia (HIF): Mediador Central en la Respuesta a la Hipoxia

1. El Factor Inducible por Hipoxia (HIF): Mediador Central en la Respuesta a la Hipoxia

2. HIF-1 • Factor de transcripción heterodimérico y ubicuo • Perteneciente a la familia PAS de factores de transcripción(ver Kewley et al, 2004) • Dos sub-unidades: HIF-1 (826aa) y HIF-1 (774/789aa) • Dominios b-HLH-PAS en la porción N-terminal: • Dominio basico y porcion C-terminal de PAS  unión al ADN • Porcion N-terminal de PAS  heterodimerización

3. La porción C-terminal de HIF-1: dos dominios de activación transcripcional (TADs) amino y carboxi terminal (N-TAD y C-TAD), además de un dominio ODD. • TADs: Importantes en la regulación post- traduccional de HIF-1 : hidroxilación, fosforilación, acetilación y/o modificaciones redox • TADs: Regulación de la activación génica a través de la unión de coactivadores transcripcionales: • a. Interacción con factores de transcripción generales asociados a la RNA pol II • b. Actividad histona acetiltrasferasa

4. ODD (O2-dependent Degradation Domain): Involucrado en la regulación de la estabilidad de la sub-unidad  • Estabilidad de HIF-1 estrechamente ligada a la disponibilidad de O2 • HIF-1 presenta un solo dominio

5. Representación esquemática de la estructura de HIF-1

6. HIF-1: Mecanismo de Acción y Regulación • Normóxia: HIF- interactúa a través del dominio ODD con un complejo multimérico con actividad ubiquitin ligasa. • Complejo ubiquitin ligasa: • Proteína supresora tumoral von Hippel Lindau (pVHL): sub-unidad de reconocimiento de sustrato. Dependiente de hidroxilación de Pro-564 y Pro-402 • Unión de pVHL (dominio ) a elongin B y C (formación complejo VBC) es facilitada por la chaperonina citosolica CCT: impide autoubiquitinación

7. Complejo pVHL

8. Complejo VBC se une a cullin2 y Rbx1  complejo VBC-CR. • Unión de E2 • Unión pVHL y HIF-1: Dominio  de pVHL.  sandwich “core” hidrofóbico y residuos polares  formacion de puentes de hidrogeno e interacciones de van der Waals (ver Min et al., 2002) • Poliubiquitinación de HIF-1 degradación proteosomal.

9. Ensamblaje del Complejo Ubiquitin Ligasa

10. Hipóxia: HIF- estabilizado. Supresión de la interacción HIF-/pVHL • Acumulación citosólica de HIF-. Translocación autónoma y heterodimerización con HIF-1 en el núcleo celular  complejo de unión al ADN • HIF-1 (HIF-1/ HIF-1) sitios de consenso de unión HIF-1/ADN (HBS) presentes en los HREs, en la región 5´o 3´ de los genes regulados por la disponibilidad de O2

11. Esquema simplificado de acción de HIF-1

12. Regulación de la actividad transcripcional de HIF: hidroxilación, fosforilación y modificaciones redox en los dominios de activación transcripcional y en dominio N-terminal de unión al ADN. • Unión de coactivadores transcripcionales generales • histona-acetiltransferasa CBP/p300 • SRC-1 (Steroid Receptor Coactivator 1) • TIF2 (Transcription Intermediary factor 2) • Mecanismos de retroalimentación negativa de HIF- al nivel de ARNm, proteína y actividad transcripcional • P35srj: unión al dominio CH1 de CBP/p300 bloqueando la interacción con HIF • “Downregulation” del ARNm con exposiciones prolongadas

13. Algunos factores que afectan la estabilidad y/o la actividad transcripcional de HIF • Co2+ (CoCl2) • Deferroxiamina (DFO) • NO • CO • H2O2 • N-etil-maleimida (NEM) • Genistein (inhibidor tirosina quinasa) • NaF (inhibidor serina/treonina fosfatasa)

14. Homólogos b-HLH-PAS: distribución y actividad • Pertenecientes a la familia b-HLH-PAS • Características comunes: • Homología de secuencia • Organización genómica • Estabilizados por hipoxia • Heterodimerización con ARNT(s) • Reconocimiento y unión a secuencia de ADN • Transactivación de genes “reporter”

15. HIF-2: Inicialmente denominado “Proteína PAS Endotelial” (EPAS) • Expresión complementaria a HIF-1 en diferentes tejidos • HIF-3: • Variante de “splice” de HIF-3 • IPAS (Inhibitory PAS Protein): Carece de C-TAD • Efecto inhibitorio en actividad transcripcional

16. ARNT2: • Puede formar heterodímeros con HIF-1, HIF-2 y HIF-3 • Expresión posiblemente restringida a cerebro y riñón • ARNT3 (MOP3): • Dimerización débil con HIF- • No participa en la respuesta hipóxica

17. Sensores de Oxígeno • Cuatro hipótesis: • I. Canales Iónicos • II. Proteínas Hem/NADPH Oxidasas • III. Cadena Respiratoria Mitocondrial y ROS • IV. Dioxigenasas 2-oxoglutarato/Fe(II) dependientes: prolina y asparagina hidroxilasas

18. I. Canales Iónicos • Propuesto como mecanismo de respuesta rápida • Independiente de inducción de la expresión génica • Canales iónicos regulados por O2: • Células excitables en los quimioreceptores arteriales y de las vías aéreas (cuerpos carotideos y neuroepiteliales). Liberación de neurotransmisores • Músculo liso de la vasculatura pulmonar y sistémica

19. Células neurosecretoras sensibles al O2 • Ej. Células Tipo I de los cuerpos carotideos (“glomus cells”) • Excitación dependiente de la presencia de canales iónicos cuya actividad depende de la PO2 • Canales de K+ • Hipoxia inhibición de iK+ despolarización apertura canales de Ca+2 cascada de señalización celular • Probablemente componente secundario en la cascada

20. II. Proteínas Hem/NADPH Oxidasas • Primeros mecanismos moleculares propuestos como sensores de las variaciones de O2 en las células de mamíferos • Basada en la afinidad del O2 por grupos prostéticos con átomos de hierro o con núcleos de hierro-azufre • Unión reversible al O2  cambios alostéricos que resultan en la adopción de una conformación oxigenada o desoxigenada • Dependiendo de la disponibilidad de O2, la conformación adquirida inicia la respuesta transcripcional requerida para mantener la homeostasis de O2

21. Proteínas Hem: Representación esquemática

22. Expresión de Epo inducida por : • Hipoxia • Co2+, Ni2+ • Deferroxiamina • Supresión de expresión de Epo y VEGF: • CO

23. En contra: • CO y DFO pueden actuar a través de una vía distinta • CO puede inhibir a HIF • No constituye evidencia

24. NADPH Oxidasa • Modularía la producción de especies reactivas de O2 (ROS) de acuerdo a la disponibilidad de éste • Conversión de O2 a ROS, cataliza la producción del radical O2–• • O2–• transformado a H2O2 por acción de superóxido dismutasa.

25. Tasa de producción de H2O2 es directamente proporcional a los incrementos de la PO2 pericelular • Normoxia: la expresión de Epo seria baja debido a las altas concentraciones de H2O2 • Hipoxia: la producción de H2O2 es menor permitiendo una mayor expresión del gen de Epo

26. A favor: • Incubación de células HepG2 con H2O2 en condiciones hipóxicas suprime la inducción de Epo • H2O2 inhibe la estabilización de HIF-1 En contra: • Inhibición selectiva de NADPH oxidasa no logra reproducir los efectos de la hipoxia • DPI bloquea la inducción del ARNm de Epo así como la unión HIF-1/ADN en células expuestas a hipoxia. Opuesto a lo predicho ya que la inhibición de la producción de O2– • debería imitar los efectos de la hipoxia.

28. III. Cadena Respiratoria Mitocondrial y ROS • Cadena respiratoria mitocondrial conforma un centro sensor de O2 y de producción de ROS de acuerdo a la disponibilidad de O2. • Hipoxia: cadena respiratoria se inhibe parcialmente, produciendo cambios redox en los transportadores electrónicos que culminan en un incremento de la producción de ROS a nivel del complejo III (Ubiquinona: Citocromo c oxido-reductasa) • ROS son liberadas al citosol y actúan como segundos mensajeros oxidantes, ocasionando finalmente la estabilización de HIF- y como consecuencia la activación de la respuesta transcripcional.

29. Células Hep3B: incremento en la producción de ROS incubadas en condiciones hipóxicas • Incremento en conjunto con la acumulación de HIF-1 y el aumento en la expresión de Epo, enzimas glicolíticas y VEGF.

30. Células 0: Hep3B carentes de ADN mitocondrial y de una cadena respiratoria funcional • Rotenona, Mixotiazol, MPTP (inhibidores) • Oxido Nitrico (NO: adición de succinato o antioxidantes • Existe aun controversia acerca de la mitocondria como sensor primario de O2 ya que las ROS producidos en el complejo III podrían actuar a un nivel diferente de la cascada de señalización

32. IV. Prolina y Asparagina Hidroxilasas • Interacción entre HIF-1 y pVHL depende de la hidroxilación de residuos de prolina en el dominio ODD mediada por una proteína con actividad prolina hidroxilasa • Reacción catalizada requiere de oxígeno molecular (O2) además de 2-oxoglutarato como co-sustrato, y Fe2+ como cofactor

33. Asparagina hidroxilasa (FIH-1) : en presencia de O2 el dominio C-TAD es hidroxilado enzimáticamente en un residuo conservado de asparagina (Asn-803) y que esta modificación impide la unión de coactivadores transcripcionales.