การทดสอบประสิทธิภาพผลิตภัณฑ์ฆ่าเชื้อด้วยวิธี Use dilution ตามวิธีมาตรฐาน AOAC 2010 chapter 6

1. การทดสอบประสิทธิภาพผลิตภัณฑ์ฆ่าเชื้อด้วยวิธี Use dilution ตามวิธีมาตรฐาน AOAC 2010 chapter 6 กลุ่มตรวจสอบคุณภาพยาสัตว์และวัตถุอันตราย สำนักตรวจสอบคุณภาพสินค้าปศุสัตว์ กรมปศุสัตว์

2. ขอบข่าย ใช้ในการทดสอบประสิทธิภาพการฆ่าเชื้อด้วยวิธี Use dilution ในผลิตภัณฑ์ฆ่าเชื้อที่สามารถละลายน้ำได้ ว่าฆ่าเชื้อได้ตามที่อัตราส่วนฉลากระบุไว้ หรือเป็นการยืนยันผล ค่าสัมประสิทธิ์ฟีนอล และเพื่อใช้พิจารณาระดับความเจือจางสูงสุดของผลิตภัณฑ์ฆ่าเชื้อ ที่เหมาะสำหรับการนำมาใช้ฆ่าเชื้อ ซึ่งเชื้อที่ใช้ทดสอบคือ - Staphylococcus aureus ATCC 6538 - Salmonella Choleraesuis ATCC 10708 - Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442

3. หลักการ ในการทดสอบประสิทธิภาพการฆ่าเชื้อวิธี Use dilution เป็นการทดสอบตามอัตราส่วนที่ฉลากระบุ โดยใช้ผลิตภัณฑ์ฆ่าเชื้อละลายในน้ำ หรือกรณีผลิตภัณฑ์ไม่กำหนดอัตราส่วนการใช้ต้องทำการทดสอบหาค่าสัมประสิทธิ์ฟีนอล(PC) เมื่อได้ค่า PC แล้วนำตัวเลข 20 มาคูณ เนื่องจาก Phenol ที่ระดับความเจือจาง 1:20 จัดเป็นระดับความเจือจางมาตรฐานในการนำไปใช้ของน้ำยาฆ่าเชื้อ ในการทดสอบ Use dilution ใช้ Stainless steel cylinder เป็นตัวแทนพื้นผิว ในการทดสอบ 60 หลอดทดสอบ สามารถมีเชื้อจุลินทรีย์ที่เจริญได้เพียง 1 หลอดทดสอบ ภายในเวลา 10 นาที

4. ขั้นตอนการทดสอบ 1. การเตรียมเชื้อจุลินทรีย์ก่อนการทดสอบ -70 NB 10 mL บ่ม 37±1 oC 18 -24 h.

5. MSA TSA streak Staphylococcus aureus NB 10 mL XLD TSA Salmonella Choleraesuis NA Slant บ่ม 37 ± 1 oC 48 ± 2 h. เก็บที่ 2 – 5 oC 30 ± 2 วัน Cetrimide TSA Pseudomonas aeruginosa

6. MSA XLD Cetrimide TSA TSA TSA Staphylococcus aureus Salmonella Choleraesuis Pseudomonas aeruginosa Microscope Microscope Microscope

7. การอ่านผลทดสอบทางชีวเคมีการอ่านผลทดสอบทางชีวเคมี Staphylococcus aureus Salmonella Choleraesuis Pseudomonas aeruginosa

8. 2.ขั้นตอนการเพาะเชื้อสำหรับการทดสอบ2.ขั้นตอนการเพาะเชื้อสำหรับการทดสอบ 1 loop (10µl.) 10 loop (100µl.) 1 loop (10µl.) NB 10 mL บ่ม 36±1 oC 22 -26 h. NB 10 mL บ่ม 36±1 oC 22 -26 h. (ต่อเนื่องอย่างน้อย 3 วัน) NB 100 mL บ่ม 36±1 oC 48-54 h.

9. 3. การเตรียม Carrier แช่ 1 M NaOH ประมาณ 12 ชั่วโมง หรือ 1 คืน ถังขยะ ล้างด้วยน้ำจากก๊อก และเช็คความเป็นกรด-ด่าง ด้วย 1% Phenolphthalein จนไม่มีสี แล้วล้างด้วยน้ำ DI อีก 2 ครั้ง นำ Carrier ที่ผ่านการล้างแล้วนำมาใส่ในขวด Bottle solution และเติมน้ำ RO ให้ท่วม นึ่งฆ่าเชื้อที่ 121 oC15 นาที

10. 4.ขั้นตอนการเตรียมตัวอย่าง4.ขั้นตอนการเตรียมตัวอย่าง ตวงน้ำ example Aseptic technical Beaker Pipette Bottle solution

11. example solution 10 mL example solution 20.0 Water bath 20±1 oC

12. 4.ขั้นตอนการทดสอบ Pipette 25 mL แช่เชื้อ 15±2 นาที

13. SET 1 Plate 1 Plate 2 Plate 3 36.0 Dry 36±1 oC 40±2 นาที

14. นำ Carrierมาทดสอบ สุ่ม Carrier เพลทละ 1 อัน เพื่อนำมาทำการทดสอบการควบคุมคุณภาพ และสุ่มอีก 2 อันใน 1 set เพื่อทำ Control positive 30±5 S 20.0

15. 20.0 30±5 S 36.0 บ่ม 36±1 oC 48±2 ชั่วโมง Letheen broth 10 mL

16. การควบคุมคุณภาพ - Quantitation of Test organism 1000 µL 1000 µL 1000 µL 1000 µL 1000 µL Test culture 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 1000µL 10-6 10-6 10-7 10-7 10-8 10-8 Pour plate 10-6 10-6 10-7 10-7 10-8 10-8 TSA Mix ให้ผสมกันดี ตั้งไว้ให้แห้งจากนั้นนำไปบ่มที่ 36±1 oC 24 – 48 h.

17. - Enumeration & Quantitation of Test organism on Carrier Letheen broth 10 mL Sonicator 1 min ± 5 sec 1 min

18. 1000 µL 1000 µL 1000 µL 1000 µL 1000 µL 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 100 µL 10-6 10-6 10-7 10-7 10-8 10-8 Pour plate 10-6 10-6 10-7 10-7 10-8 10-8 TSA Mix ให้ผสมกันดี ตั้งไว้ให้แห้งจากนั้นนำไปบ่มที่ 36±1 oC 24 – 48 h.

19. - Control positive, Control negative, Control sample นำไปบ่มที่ 36±1 oC 24 – 48 h. Control negative นำไปบ่มที่ 36±1 oC 24 – 48 h. Control positive Pipette 1 mL นำไปบ่มที่ 36±1 oC 24 – 48 h. example solution Control sample

20. 6.การอ่านผลการทดสอบ • การทดสอบ Use dilution อ่านผลการทดสอบโดยดูจากหลอดทดสอบทั้ง 60 หลอด ว่ามีเชื้อเจริญหรือไม่ เกณฑ์การยอมรับคือ ใน 60 หลอดทดสอบสามารถมีเชื้อเจริญได้ไม่เกิน 1 หลอด แต่การทดสอบดังกล่าวยังตอบผลว่าผ่านไม่ได้ เนื่องจากต้องดูผลการควบคุมคุณภาพประกอบด้วย จึงสามารถระบุว่าการทดสอบผ่านหรือไม่ผ่าน

21. การอ่านผล Quantitation of Test organism & Test organism on Carrier • การอ่านผลทั้งสองการทดสอบนี้ใช้วิธีการอ่านผลคือ นับปริมาณเชื้อแล้วนำปริมาณเชื้อที่อยู่ในช่วง 25 – 250 โคโลนี มาคำนวณตามสูตร ดังต่อไปนี้ c n = (1 × n1) + (0.1 × n2) × d c = ผลรวมโคโลนีทั้งหมดที่นับได้ในช่วง 25 – 250 โคโลนี n1 = จำนวนเพลทที่นับได้ใน dilution แรก n2 = จำนวนเพลทที่นับได้ใน dilution ที่สอง d = dilution แรกที่นับได้ หมายเหตุ : หากเป็นการทดสอบ Test organism on Carrier ให้คูณด้วย 10

22. ตัวอย่าง ผลการนับปริมาณเชื้อมีดังนี้ 10-6 = 250, 309 10-7 = 98, 65 10-8 = 15, 24 นำค่าที่อยู่ในช่วง 25 – 250 มารวมกัน = 250 + 98 + 65 = 453 แทนค่าในสูตร 413 n = (1 × 1) + (0.1 × 2) × 10-6 n = 344.16 × 106 n = 3.44 × 108 ( Carrier 3.44 × 10 × 108 ) CFU/mL

23. การอ่านผล Enumeration • อ่านผลโดยนับปริมาณเชื้อแล้วนำปริมาณเชื้อที่อยู่ในช่วง 0 – 300 โคโลนี มาคำนวณตามสูตร ดังต่อไปนี้ CFU/mL = (avg. CFU for 10-x)+(avg. CFU for 10-y)+(avg. CFU for 10-z) 1 10-x+ 10-y+ 10-z CFU/mL = CFU/mL × 10 mL of broth / Carrier 2 นำค่า CFU/Carrier มา taking the log10ซึ่งต้องได้ค่า ≥ 6 หากได้ค่าน้อยกว่า 6 แสดงว่า การ Dry carrier ไม่ดีหรือเกิดการปนเปื้อนในตัวอย่างทดสอบ จึงต้องทำการทดสอบซ้ำจนกว่าจะได้ค่าอยู่ในเกณฑ์การยอมรับคือ ≥ 6

24. ตัวอย่างการอ่านผล Enumeration

25. แทนค่าในสูตร CFU/mL = (247.05)+(66.16)+(19.05) 10-6+ 10-7+ 10-8 CFU/mL = 332.26 1.11 × 10-6 CFU/mL = 3.0 × 108 CFU/Carrier = 3.0 × 108 × 10 CFU/Carrier = 3.0 × 109 CFU/log10 = 9.477 สรุป : ผลการทดสอบ Enumeration ผ่าน เนื่องจากมีค่ามากกว่าเกณฑ์การยอมรับคือ ≥ 6

26. การอ่านผล Control positive, Control negative, Control sample • Control positive ผลผ่านต่อเมื่อมีเชื้อเจริญ • Control negative ผลผ่านต่อเมื่อไม่มีเชื้อเจริญ • Control sample ผลผ่านต่อเมื่อไม่มีเชื้อเจริญ

27. การทดสอบ Neutralization p p p สุ่มหลอดทดสอบ 6 หลอด p p p

28. 1000 µL 1000 µL 1000 µL 1000 µL 1000 µL 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 เชื้อทดสอบ อายุ 24 – 48 h. 100 µL 100 µL Pour plate Pour plate

29. ผลการทดสอบจะต้องมีเชื้อเจริญทุกหลอดทดสอบจึงจะให้ผลผ่านการทดสอบ หากไม่มีเชื้อเจริญแสดงถึงการทดสอบมีสารหรือยาฆ่าเชื้อติดมาใน Carrier มากเกินไป ผลการทดสอบจะต้องอยู่ในช่วง 10 – 100 โคโลนี