Atelier sécrétion

1. Atelier sécrétion Charlotte GAVIARD 2013/2014 Master 2 MBVB

2. -Bactérie aquatique mobile en forme de bâtonnet incurvé - Gram – - Pathogène : responsable du choléra chez l’Homme - Classe : gamma protéobactérie Vibriocholerae : Harward gazette (9 décembre 2010)

3. Six systèmes de sécrétion sont décrits pour les bactéries Gram - Cours de Microbiologie ; Michel Pronovost Master 1 ; TAM ; S. Bleves

4. Le SST6 • Transport de protéines • hors des cellules effectrices • à l’intérieur d’une cellule cible • Interaction : • bactérie/hôte • bactérie/bactérie Angela R. Records. 2011

5. Exemples de clusters de gènes codant pour le SST6 dans différentes bactéries Sarah J. Coulthurst. 2013 13 gènes conservés = « composants cœurs » Ils forment le complexe minimal nécessaire à la formation du SST6

6. Le modèle actuel du fonctionnement du SST6 est le modèle dit « du phage inversé » Bactériophage T4 SST6 Angela R. Records. 2011

7. Le modèle actuel du fonctionnement du SST6 est le modèle dit « du phage inversé » Bactériophage T4 SST6 VgrG gp27-gp5 Angela R. Records. 2011

8. Le modèle actuel du fonctionnement du SST6 est le modèle dit « du phage inversé » Bactériophage λ SST6 Hcp gp19 Angela R. Records. 2011

9. Le modèle actuel du fonctionnement du SST6 est le modèle dit « du phage inversé » Bactériophage T4 SST6 gp25 gp25-like Angela R. Records. 2011

10. Le modèle actuel du fonctionnement du SST6 est le modèle dit « du phage inversé » Bactériophage T4 SST6 gp18 VipA/VipB Angela R. Records. 2011

11. 2012

12. VipA-sfGFP est une structure très dynamique Microscopie à fluorescence ΔvipA + vipA-sfGFP VipA forme des structures droites de longueur variable 0 à 5 structures par cellule Temps réel : 10 min Contraction 1 μm Vitesse d’assemblage : 20 à 30 s/μm

13. Quelques uns des différents contrôles : - La construction VipA-sfGFP complémente la délétion du gène vipA sur le chromosome de V. cholerae. - Le niveau d’expression de VipA-sfGFP est comparable à celui de VipA • La structure dynamique VipA-sfGFP est la même : - dans différentes souches de V. cholerae (2740-80ΔvipA + vipA-sfGFP vs V52ΔvipA + vipA-sfGFP) - dans une souche sauvage et délétée de vipA • (WT + vipA-sfGFP vs ΔVipA+ vipA-sfGFP) - avec sf-GFP ou mCherry2 (ΔVipA + VipA-sfGFP et  ΔVipA + VipA-mCherry2)

14. La structure VipA-sfGFP se localise dans le cytosol Western Blot

15. La structure VipA-sfGFP se contracte en moins de 5 ms ΔvipA + vipA-sfGFP 30 frames average Kymogramme ; 200 images/s Length (μm) 1 μm Time (ms)

16. La structure VipA-sfGFP se contracte sur 50% de sa longueur et se désassemble dans les 30 à 60 prochaines secondes ΔvipA + vipA-sfGFP 1 μm La conformation de la structure est estimée par l’analyse de l’intensité du signal de fluorescence à un point donné 1 μm 1 μm

17. La structure VipA-sfGFP : • - est une structure très dynamique • s’étend en quelques dizaines de secondes dans différentes localisations cellulaires • se contracte en moins de 5 ms sur 50 % de sa longueur • - se désassemble dans les 30 à 60 secondes après sa contraction • - est perpendiculaire à la membrane cellulaire • se localise dans le cytosol

18. Les structures tubulaires se présentent sous deux conformations différentes ECT ; coupes de cellules entières Structure étendue Structure contractée 100 nm 100 nm

19. Les structures tubulaires sont perpendiculaires à la membrane cellulaire et se localisent dans le cytosol Plateforme basale : jaune Structure tubulaire : rouge

20. Caractéristiques des structures tubulaires ‘étendues’ et ‘contractées’ ECT ; coupes de cellules entières Structure étendue Structure contractée Longueur : 667 +/- 83 nm 100 nm Longueur : 372 +/- 56 nm 100 nm Diamètre : 11,6 +/- 0,7 nm Intérieur dense Surface homogène Diamètre : 14,6 +/- 0,7 nm Intérieur creux Surface hélicale crénelée

21. Caractéristiques des structures tubulaires ‘étendues’ et ‘contractées’ ECT après purification Structure contractée purifiée Coloration négative 20 nm Surface hélicale dentée 12 sous-unités espacées de 6 nm Queue contractile du phage T4 Lossi NS, 2013 10 nm

22. Les structures tubulaires ne sont pas en contact direct avec la membrane cellulaire ECT ; coupes de cellules entières Structure contractée Structure étendue 100 nm 100 nm 10 nm 10 nm 20 nm 20 nm Gaine : vert Plateforme basale : jaune et rose Membrane interne et externe : bleu

23. Les structures tubulaires : - se présentent sous deux conformations différentes : étendue et contractée - sont perpendiculaires à la membrane cellulaire - se localisent uniquement dans le cytosol - ne sont pas en contact direct avec la membrane cellulaire (plateforme basale) La structure contractée purifiée est similaire à la queue contractile du phage T4.

24. L’interaction VipA-VipB est nécessaire à la formation de la structure VipA-sfGFP In vitro : VipA et VipB forment des hétérodimères ΔvipB + vipA-sfGFP 3μm VipA-sfGFPdiffus

25. gp25-like joue un rôle dans la formation de la structure VipA-sfGFP ΔvipA/ΔVCA0109 + vipA-sfGFP 3μm Temps réel : 5 min VipA-sfGFPdiffus

26. ClpV est impliqué dans le recyclage de VipA/VipB constituant la gaine contractée In vitro : ClpV désassemble VipA/VipB en présence d’ATP ΔvipA/ΔclpV + vipA-sfGFP Temps réel : 5 min VipA-sfGFP forme de courtes structures Absence de polymérisation-dépolymérisation

27. Quelles protéines sont associées à la structure VipA/VipB du SST6 ? - gp25-like? (rôle dans la formation de la structure) - ClpV ? (impliquée dans le recyclage de VipA/VipB) - d’autres protéines ?

28. gp25-like, ClpV, VCA0111 et VCA0114 semblent associées à la structure VipA/VipB contractée Gel SDS-PAGE ΔflgG ClpV VipB 55 kDa VCA0111 VCA0114 VCA0114 VipA 20 kDa Structures contractées purifiées ME gp25-like

29. gp25-like, ClpV, VCA0111 et VCA0114 semblent associées à la structure VipA/VipB contractée Angela R. Records. 2011

30. VipA, VipB et gp25-like jouent un rôle dans la sécrétion de Hcp Western Blot WT ΔvipB ΔVCA0109 WT ΔvipA sup. sup. cells sup.. cells sup. cells sup.

31. V. choleraepossède une activité antibactérienne dépendante du SST6 contre E. coli  Les gènes vipA, vipB, VCA0109 et clpV(associés ou constituants la gaine du SST6) sont-ils impliqués dans l’activité antibactérienne de V. cholerae?

32. L’activité antibactérienne de V. choleraeest VipA- VipB- et gp25-like- dépendante ClpV n’est pas essentielle à 4h pour l’activité antibactérienne de V. cholerae Gentamycine Streptomycine à 37°C

33. L’activité antibactérienne de V. choleraeest VipA- VipB- et gp25-like- dépendante ClpV n’est pas essentielle à 4h pour l’activité antibactérienne de V. cholerae Gentamycine Streptomycine à 37°C

34. L’activité antibactérienne de V. choleraeest VipA- VipB- et gp25-like- dépendante ClpV n’est pas essentielle à 4h pour l’activité antibactérienne de V. cholerae Gentamycine Streptomycine à 37°C

35. L’activité antibactérienne de V. choleraeest VipA- VipB- et gp25-like- dépendante ClpV n’est pas essentielle à 4h pour l’activité antibactérienne de V. cholerae Gentamycine Streptomycine à 37°C

36. Modèle du cycle de fonctionnement du SST6 • Formation du plateau basal (gp25-like, VgrG, …) qui traverse la MI, le PG et la ME • Polymérisation du tube Hcp • Polymérisation de la gaine à partir des hétérodimèresVipA/B autour du tube Hcp

37. Modèle du cycle de fonctionnement du SST6 Le SST6 est prêt à l’emploi

38. Modèle du cycle de fonctionnement du SST6 • Signal extracellulaire inconnu • changement conformationnel du plateau basal • contraction de la gaine • translocation du complexe VgrG/Hcp à travers la membrane cellulaire de l’effecteur • et pénétration de la membrane cellulaire de la cellule cible adjacente

39. Modèle du cycle de fonctionnement du SST6 • La gaine contractée se détache et se désassemble à partir du site d’extension à l’aide de ClpVATPase dans le cytosol • Les hétérodimèresVipA/B sont recyclés pour la formation d’un nouveau SST6

40. Modèle du cycle de fonctionnement du SST6

41. Comment se fait l’assemblage ? ATP-dépendant ? ATP-dépendant Assemblage Désassemblage

42. Chez d’autres bactéries ?

43. Merci de votre attention Charlotte GAVIARD 2013/2014 Master 2 MBVB

44. Suppléments

45. Clusters de type 6 de V. cholerae

46. VgrG (E. coli CFT073) : homologue structural de gp27-gp5 (Bactériophage T4) Bactériophage T4 SST6 (gp27)3-(gp5)3 (VgrG)3 Modèle Kanamaru et al., Nature 2002 Leiman et al., PNAS 2009

47. Western Blot

48. Western Blot

49. ΔvipA + VipA-sfGFP V52 ΔvipA + vipA-sfGFP ΔvipA + vipA-smCherry2 WT + vipA-sfGFP 3μm

50. ME de structure tubulaire purifiée ΔVipA et ΔVipB : structure tubulaire absente flagelle présent ΔVipA + VipA-sfGFP WT ME