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Le tribolazioni di una proteina di membrana

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b 6. IV. FeS. cyt f. Francesca Zito IBPC CNRS UMR 7099. Le tribolazioni di una proteina di membrana. Le proteine di membrana costituiscono il 20-30\% dei genomi completamente sequenziati ma ottenera la loro struttura rappresenta ancora una sfida genoma unano: 40-60 000 geni. 60-70 \%

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- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
slide1
b6

IV

FeS

cyt f

Francesca Zito

IBPC CNRS UMR 7099

Le tribolazioni di una proteina di membrana

slide2
Le proteine di membrana costituiscono il 20-30% dei genomi completamente sequenziati ma ottenera la loro struttura rappresenta ancora una sfida

genoma unano: 40-60 000 geni

60-70 %

proteine solubili

30-40 %

Proteine di membrana

~ 6000 strutture

~ 20 strutture

slide3
RMN

Biochimica

Cristallografia

Genetica molecolare

Fd

E

C

D

struttura

H

G

J

M

K

I

L

P700

funzione

N

F

PC

Biochimica Spettroscopia

slide4
PQ

PQ

PQ

Fd

PSII

ATP

ADP + Pi

a

b

d

b

a

b

a

e

II

I

g

E

C

D

CP43

CP47

D1

D2

A B

Qi

A0

bh

III

III

III

III

III

IV

IV-cyt b6

Lhcbi

Lhcbi

M

G

L

X

M

J

K

W

I

E

F

L

H

N

H

G

J

M

K

I

L

Lhcbi

Qo

bl

P700

R

O

N

ISP

F

P

T

PC

3 H+

Q

CP43

CP47

cyt f

2 H2O

4H+ + O2

PC

ATPsynthase

cyt b6f

PSI

slide5
PQ

PQ

ATP

ADP + Pi

d

II

I

b6

IV

L

bl

FeS

Q

F

P

3 H+

cyt f

2 H2O

4H+ + O2

Antennes

PSII

cyt b6f

PSI

ATPsynthase

(mitochondrie)

slide6
C

N

C

N

C

stroma

C

C

C

L

N

f

b6

b6

b6

b6

IV

G

M

IV

IV

Rieske

lumen

N

N

N

N

C

slide7
Cytochrome c oxidase

PS I

Complex I

+

PS II

2H

stromal

cytb6+IV/cytb

in

-

e

Q

QH

b

H

2

[function : b6 f & bc1]

-

e

-

e

b

QH

QH

L

2

2

out

-

-

e

+

luminal

e

2H

PC

cyt

-

e

Rieske

cyt

f/c

1

slide8
+

H

-

e

PS I

+

PS II

2H

cytb6+IV

Kinase ?

-

e

State

transitions

Q

QH

b

2

H

[function : b6fvs.bc1]

-

e

-

e

b

QH

QH

L

2

2

-

-

e

+

e

2H

PC

cytc

-

e

Rieske

+

cyt

f

H

slide9
+

H

-

e

PS I

?

PS II

+

2H

?

-

e

in

Q

QH

b

2

H

-

e

-

e

b

QH

QH

L

2

2

-

out

-

e

+

e

2H

PC

cyt

Rieske

Cyt f

+

H

slide10
Institut de Biologie Physico-Chimique

UMR 7099, CNRS/Université Paris-7

l l l l l

f R b6IV4 kDa

SDS-PAGE analysisof Chlamydomonasb6f complex

purified in Hecameg/egg PC mixed micelles

(TMBZ + silver)

slide11
Institut de Biologie Physico-Chimique

UMR 7099, CNRS/Université Paris-7

l l l l l

f R b6IV4 kDa

subIV

PetG

PetL

PetM

PetN

cytb6

N

C

N

C

C

C

N

stroma

C

C

) x 2

bH

β-car.

A

D

B

C

bL

Chla

N

N

N

C

lumen

N

Fe2S2

Rieske

protein

cytf

slide12
Institut de Biologie Physico-Chimique

UMR 7099, CNRS/Université Paris-7

l l l l l

f R b6IV4 kDa

subIV

PetG

PetL

PetM

PetN

cytb6

N

C

stroma

N

C

C

C

N

C

C

bH

β-car.

A

D

B

C

bL

Chla

N

N

N

C

lumen

N

Fe2S2

Rieske

protein

cytf

homology to bc1

slide13
Institut de Biologie Physico-Chimique

UMR 7099, CNRS/Université Paris-7

subIV

PetG

PetL

PetM

PetN

cytb6

N

C

stroma

N

C

C

C

N

C

C

bH

β-car.

A

D

B

C

bL

Chla

N

N

N

C

lumen

N

Fe2S2

Rieske

protein

cytf

homology to bc1

structure solved

slide14
Cristallizazione di una proteina di membrana

Solubilizzazione e Purificazione

- Détergente

+ Détergente

Aggregazione

Dissociazione

Manipolazione in soluzione

Cristallizazione

slide15
Institut de Biologie Physico-Chimique

UMR 7099, CNRS/Université Paris-7

EM on 2D crystals

3D crystals

100 µm

Crystals from Hecameg/PC solution Cryo-EM projection map

(Stroebel & Picot, unpublished) (Breyton, 2000)

slide16
b6 f

Purificazione del complesso selvatico

Risultato della purificazione:

- Pura, actifttiva.

- 3mg/ 20ml di membrane.

 Particolarità:

- Presenza di lipidi esogeni con ruolo stabilizzatore

- Variabilità.

- Difficile da modificare

(hydroxylapatite)

Hécameg-lipides à 4°C

Solubilisation

25mM HG

Gradient de

saccharose

20mM Hécameg

+ 0.1 g/l lipides

Colonne

d’hydroxylapatite

Ref.: Pierre et coll (1995) J. Biol. Chem. 270, 29342-29349.

slide17
Cristalli piccoli e difficili da riprodurre

100 mm

Ago in fase cubica

100 mm

Ref.: E. Landau & J. Rosenbuch (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 14532-14535.

slide18
Institut de Biologie Physico-Chimique

UMR 7099, CNRS/Université Paris-7

His6

subIV

PetG

PetL

PetM

PetN

cytb6

N

C

stroma

N

C

C

C

N

C

C

bH

β-car.

A

D

B

C

bL

Chla

N

N

N

C

lumen

N

Fe2S2

Rieske

protein

cytf

slide19
Purificazione di un complesso portante un etichetta poli-istidina

Solubilisation

Risultato della purificazione:

- Pura, attiva.

- 2mg /20ml di membrane.

 Particolarità:

- Possibilità di lavorare senza lipidi esogeni.

- Risultati riproduttibili.

- Protocollo rapido e flessibile

- Cristalli dopo 4 giorni

Colonne d’échange

d’ions

b6 f

FPLC

Colonne

de nickel

b6 f

FPLC

Colonne de dessalage

FPLC

slide20
500 µm

400 µm

500 µm

Cristallisation

Cyt f

Rieske

Cyt b6

SuIV

pt su

SDS-PAGE

di un cristallo

100 mm

slide21
b6

IV

FeS

cyt f

Purificazione in hecameg

i cristalli non ci soddisfano

H

Purificazione su colonna di affinità

Buoni cristalli!

b6

IV

FeS

cyt f

slide22
Institut de Biologie Physico-Chimique

UMR 7099, CNRS/Université Paris-7

400 µm

Crystal grown from C12-M solution in the presence of C13-stigmatellin

slide23
Institut de Biologie Physico-Chimique

UMR 7099, CNRS/Université Paris-7

~200 µm

Crystal in cryo-loopDiffraction pattern (ESRF line BM30A)

slide24
H

b6

IV

b6

IV

FeS

3,1 Å

FeS

cyt f

cyt f

100 mm

slide26
stroma

lumen

slide29
bH

bL

Fe2S2

f

slide30
bH

bL

Fe2S2

c1

f

~16 Å

--- b6 f

--- bc1

slide31
Rieske TMH

Cyt f TMH

PetL

B

PetN

b6

A

E

4-kDa

subunits

PetM

PetG

C

D

F

IV

G

Cytochrome b6f transmembrane region – view from the lumen side

slide32
bc1

G

QP-C

H

F

IX

Rieske

f

c1

PetL

D

B

PetN

A

E

C

PetG

b6f

[transmembrane helices, b6f + bc1]

PetM

PetM

PetG

E

PetN

C

A

B

PetL

f

D

c1

Rieske

IX

F

QP-C

H

G

--- Chlamydomonasb6 f

--- yeast bc1(1KB9 ; Lange et al., EMBO J. 20:6591, 2001)

slide34
chlorophyll a

2 Fo – Fc (contouring at1 σ)

slide36
chlorophyll a

C13-stigmatellin

ad