STUDIO FUNZIONALE DI UNA PROTEINA ATTRAVERSO LA SUA INTERAZIONE CON ALTRE PROTEINE

1. STUDIO FUNZIONALE DI UNA PROTEINA ATTRAVERSO LA SUA INTERAZIONE CON ALTRE PROTEINE - Cromatografia per affinità (saggio in vitro) (es: saggi pull-down) - Phage display (saggio in vivo) - Sistema del doppio ibrido di lievito (saggio in vivo)

2. Concetto di dominio proteico Un dominio può quindi essere definito come un’unità strutturale, con ripiegamenti tridimensionali, che costituisce una unità funzionale autonoma rispetto al resto della proteina, che di solito è evolutivamente conservata I domini proteici vengono di solito identificati e classificati rispetto alle loro caratteristiche strutturali, funzionali ed evolutive.

3. Cromatografia per affinità (saggio in vitro) Una certa proteina (“esca”) viene immobilizzata su una matrice di supporto inerte di una colonna cromatografica nella quale viene fatto passare un lisato cellulare. In genere la proteina “esca” è fusa con un’altra proteina (attaccata alla matrice solida). Le proteine (prede) che interagiscono con l’esca sono trattenute nella colonna, le altre trascinate via. Successiva eluizione aumentando la concentrazione salina del tampone ESCA Proteina di fusione (es: una certa proteina fusa con GST) PREDA Proteina da individuare

4. CROMATOGRAFIA PER AFFINITA’ (saggio di pull-down)

5. Tag = GST CROMATOGRAFIA PER AFFINITA’ (pull down) Colonna con Glutatione Una “esca” cattura un complesso proteico Analisi della/e proteina: digestione proteolitica e spettrometria di massa

6. Phage-display • “Esibizione” di proteine sulla superficie di un batteriofago filamentoso, • es: M13 • Fusione di un gene di una proteina di rivestimento del fago con • l’intero gene (oppure con dominio proteico) di interesse • Trasfezione in E. coli • Espressione della proteina ibrida nel rivestimento del fago

7. COSTRUZIONE DI UNA LIBRERIA DI PHAGE DISPLAY • Produzione di fagi ricombinanti ottenuti clonando miscele di cDNA ottenuti • da tessuti (librerie di espressione specifiche) • Ogni fago esprime ed “esibisce” una proteina di interesse fusa con quella fagica

8. COSTRUZIONE DI UNA LIBRERIA DI PHAGE DISPLAY • - Per vagliare una proteina di interesse: • - immobilizzazione della proteina su particelle in una colonna • - immobilizzazione della proteina in pozzetti di piastre da microtitolazione • - Ogni fago esprime ed “esibisce” una proteina di interesse fusa con quella fagica • Mettere a contatto una soluzione con l’intera libreria fagica • Lavare • Eluire il fago trattenuto con tampone a determinati pH o forza ionica • Caratterizzare il fago trattenuto in seguito ad infezione batterica

9. Applicazioni del Phage display • studio delle interazioni proteina-proteina • studio dell’effetto funzionale di varianti amminoacidiche

10. SISTEMA DEL DOPPIO IBRIDO IN LIEVITO L’espressione genica in S. cerevisiae dipende da fattori di trascrizione con 2 domini. Dominio di legame al DNA (Binding Domain) o BD Dominio di attivazione della trascrizione (Activation Domain (AD) Sostituzione dei fattori di trascrizione con proteine di fusione (ognuna costituita in parte da un dominio del fattore di trascrizione e in parte dalla proteina campione) Se si verifica interazione tra questa coppia di ibridi si ottiene l’espressione del gene bersaglio di lievito Ovvero: proteine che si legano fisicamente l’una all’altra vengono individuate grazie alla loro capacità di attivare la trascrizione di un gene indicatore

11. I due vettori ibridi derivanti dal 2 µ selezionati in E. coli, poi introdotti stessa cellula di lievito, oppure fusione di 2 ceppi aploidi lievito Il dominio BD si può legare al DNA ma la trascrizione inizia solo se viene portato AD nella giusta posizione Preda o

12. Interazione tra i 2 domini = GAL4 attivo SISTEMA DEL DOPPIO IBRIDO IN LIEVITO • Utilizzo del fattore di trascrizione di lievito GAL4, che legando il promotore di LacZpermette la trascrizione della β-galattosidasi. • Se c’è interazione tra le due proteine GAL4 attiva entrambi i 2 domini e trascrive il gene LacZ. • Se nel mezzo di coltura è presente X-Gal, la β-galattosidasi è in grado di scinderla e le colonie diventano blu. β-galattosidasi + X-Gal Prom Lacz Si cresce la colonia di lievito blu e si caratterizza il plasmide con inserito il DNA della proteina preda (o bersaglio)

13. Clone 1 ibrido inserito in cellule di lievito Clone 1 e clone 2 ibridi inseriti in cellule di lievito Screening di libreria di ricombinanti

14. Applicazioni: può rivelare un gran numero di interazioni che possono facilitare la decifrazione della funzione genica Possibilità di falsi positivi e negativi da verificare con altri metodi

15. CROMATOGRAFIA PER AFFINITA’ (pull-down)