slide1 n.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
MTA SZBK DNS - Chip Laborat órium szbk.hu/chiplab~ PowerPoint Presentation
Download Presentation
MTA SZBK DNS - Chip Laborat órium szbk.hu/chiplab~

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 49

MTA SZBK DNS - Chip Laborat órium szbk.hu/chiplab~ - PowerPoint PPT Presentation


  • 122 Views
  • Uploaded on

MTA SZBK DNS - Chip Laborat órium www.szbk.hu/chiplab~. A DNS CHIPEK ÉS ALKALMAZÁSUK SZE Bioinformatika 2003.10.09. DNA-chip Lab.BRC, Szeged. Kromoszómák genetikai állomány hordozói. sejt. DNS. Gének információ hordozók. mRNS. AAAAAA. AAAAAA. AAAAAA. Fehérjék

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'MTA SZBK DNS - Chip Laborat órium szbk.hu/chiplab~' - lave


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
slide1

MTA SZBK

DNS-Chip Laboratórium

www.szbk.hu/chiplab~

A DNS CHIPEK

ÉS ALKALMAZÁSUK

SZE Bioinformatika

2003.10.09.

DNA-chip Lab.BRC, Szeged

slide2

Kromoszómák

genetikai állomány hordozói

sejt

DNS

Gének

információ hordozók

mRNS

AAAAAA

AAAAAA

AAAAAA

Fehérjék

sejtfunkciók ellátása

slide3

Néhány definíció

„Genom, avagy a DNS birodalma”:

egy szervezet

teljes DNS készlete.

„Transzkriptom, avagy a

hírvivő RNS-ek birodalma”:

egy sejten belüli,

egy időpontban jelenlévő mRNS készlet.

„Proteom, avagy a fehérje birodalom”: egy sejten belüli,

egy időpontban jelenlévő fehérje készlet.

cDNS=copy DNS, az érett mRNS DNS-sé átírt változata

Oligonukleotid=néhány tíz nukleotidból álló DNS darab

DNA-chip Lab.BRC, Szeged

slide4

A genomprogram

  • Humán Genom Projekt és a Celera Genomics nevű biotechnológiai óriás 2000-ben együttesen jelentették be az emberi genetikai állomány kódjának közel teljes megfejtését.
  • 2001 februárjának közepén hozta nyilvánosságraeddigi eredményeit a világ két legrangosabb tudományos folyóiratában, a Nature, illetve a Science lapjain.
  • „Az emberiség 100,000 éves történelmének egyik legfontosabb napja, hiszen az emberek először olvashatják el saját könyvük betűit” Craig Venter, a Celera igazgatója

DNA-chip Lab.BRC, Szeged

slide5

Néhány érdekes adat az emberi genomról

  • Trillió sejt/szervezet
  • 3 milliárd betű/sejt
  • 2 méternyi DNS/sejt
  • 1betű/mp, 24 óra/nap 100év.
  • 1betű-mp, 16,5perc egy különbség.
  • 12 000 nukleotidothatároztak meg minden mp-ben Human Genome Project keretén belül
  • 3 mm-es távolságban összerakva 9000 km lenne, több mint 2x hosszabb mint a Mississippi
  • a korábbi feltételezésekkel (80-100ezer gén) ellentétben csak kb. 35ezer gén
  • a genomnak csak 1-1,5%-a kódoló, azaz exon szekvencia
  • egyenlőtlen géneloszlás-genetikai sivatagok
  • egyenlőtlen a kromoszómális eloszlás is (az XY kromoszómák sokkal kevesebb gén tartalmaznak mint pl. a 17 vagy 22-es kromoszóma
  • kb. 3millio SNP minden 1000 „beteg”
  • a rasszok jobban hasonlítanak egymásra a két nem

DNA-chip Lab.BRC, Szeged

slide6

szövet, szerv szint

T

G

P

T

G

P

sejt szint

A funkcionális molekuláris biológialényege 1.

daganat képződés, gyulladás,

különböző betegségek

Minőségi és

mennyiségi

változások

Környezeti hatások, gyógyszerek, fertőzések

funkciók

felderítése

sejtosztódás,

diffrenciáció, sejthalál

slide7

A funkcionális molekuláris biológia és diagnosztika lényege (2)

Eltérő állapotok molekuláris hátterének felderítése

Trombosis, sclerosis

DNS

RNS

fehérje

metabolitok

vizsgálata

Összehasonlítás

egészséges szövettel

Segítség:

adatbankok,

szekvenálási

projektek

DNA-chip Lab.BRC, Szeged

slide8

A funkcionális molekuláris biológialényege 3.

P

P

P

P

P

aktív gének vizsgálata

AAAAA

AAAAA

AAAAA

AAAAA

P

P

T

Minőségi és mennyiségi változások követése

Környezeti hatások, gyógyszerek, fertőzések

T

G

G

slide9

Az 1990-es években egy forradalmian

új technika,

fejlődött ki a gén

és fehérje funkciók analízisére.

Chip-technológia

A biochipek nagyszámú (több ezer)

cDNS, oligonukleotid vagy fehérjemolekula

részletet tartalmazó kémiailag aktivált tárgylemezek

A biochipek nagyszámú gén vagy fehérje együttes funkció analízisére alkalmasak

DNA-chip Lab.BRC, Szeged

slide11

A. Examination of “transcriptome” B. Examination of “proteome”

(generation of mRNA maps) (generation of protein maps)

1. Hybridization-based techniques

- Northern blotting

- RNase protection/S1-mapping

- Subtraction cloning

- DNA arrays

2. PCR-based techniques

- Differential display

- RDA (representational difference analysis)

3. Sequence-based techniques

- ESTs (expressed sequence tags)

- SAGE (serial analysis of gene expression)

- DNA sequencing chip

- Mass spectrometry sequencing

Comparative molecular expression analysis

- 2D gelelectrophoresis

- MALDI-TOF mass spectrometry

- combined electrophoretic and

microsequencing techniques

- “protein-chip” techniques

DNA-chip Laboratory, BRC. Szeged

slide12

DNS-chip technika

Hibridizálás

100-20,000

Génspecifikus

minta

Radioaktív génspecifikus próba

Dot-blot technika

A pozitív RNS minták

jelölődnek

Hibridizáció

Különböző sejtekből preparált teljes RNS-ek szilárd hordozóra kötve

Teljes RNS jelölése

Reverz dot-blot technika

Pozitív génspecifikus

minták jelölődnek

Hibridizáció

Génspecifikus minták

rögzítése szilárd hordozóhoz

DNA-chip Lab.BRC, Szeged

slide13

nylon membránon néhány 100

  • génspecifikus minta (DNS darab)
  • radioaktív jelölés
  • kis minta sűrűség
  • (100-1000 pont/cm2)

macroarray

  • üveglemezen több
  • 1.000-10.000 génspecifikus minta
  • (DNS darab)
  • fluoreszcens jelölés
  • közepes mintasűrűség
  • (5000 pont/cm2)

microarray

  • üveglemezen több
  • 10.000-100.000 génspecifikus
  • minta (DNS darab)
  • fluoreszcens jelölés
  • nagy minta sűrűség
  • (10.000pont/cm2)

chip

A chipek hordozó szerinti osztályozása

slide14

nyomtatás

Makroarray

Chip

Mikroarray

Hibridizálás, fehérje-ellenanyag

kölcsönhatás

néhány 100,

vagy több 1.000,

10.000 gén, fehérje

jelölt minta

X

Egy chipkísérlet lépései

cDNS klón és/vagy

DNS szekvencia

biológiai minta

szövetből,

sejtkultúrából

mRNS, DNS,

fehérje

adatfeldolgozás, bioinformatika, génműködésre vonatkozó

információk értékelése

slide15

CHIPKÉSZÍTÉS

cDNS alapú chip készítése

Egyedi baktérium klónok

izolálása

kék/fehér szelekció

Ismert és ismeretlen

szekvenciájú cDNS

darabokat tartalmazó klónok

PCR amplifikáció

96 mintahelyes lemezeken

cDNS könyvtár baktériumban

PCR reakció ellenőrzése

Tisztítás

felcsepegtetés üveglemezekre

Minden lemezen

több 1000 ismert

és ismeretlen

szekvenciájú cDNS

darab szerepel duplikátumban

DNA-chip Lab.BRC, Szeged

slide16

Microgrid ArrayerBioRobotics, UK

DNA-chip Lab.BRC, Szeged

slide17

Microgrid ArrayerBioRobotics, UK

  • 4, 16 tű
  • 84 lemez
  • 24 mikrotiter lemez (384)
  • Sebesség: 6400 pont < 4h.
  • Sűrűség: 20.000 pont/lemez

DNA-chip Lab.BRC, Szeged

slide18

Nyomtatótűa MicroArrayer robothoz

DNA-chip Lab.BRC, Szeged

slide19

Making microarrays by mechanical microspotting and ink jetting

Touch surface

Microarray

Small volume is transferred

to a solid surface by physical

contact between the pin and

the solid surface

Sample is loaded into

a spotting

pin by capillary action

After the first spotting

cycle, the pin is washed

and the next sample is

loaded and deposited

Move jets

Deliver drop

Wash, repeat

Microarray

An electrical current is

used to expel a precise

amount of liquid from the

jet onto the surface

Second sample is loaded

and deposited to an adjacent

address

Sample is loaded into a

miniature nozzle equipped

with a piezoelectric fitting

1. Mechanical microspotting

Move pins

Wash, repeat

Same sample can be

transferred with the

same pin to the next

solid surface generating

multiple arrays

2. Ink jetting

DNA-chip Lab.BRC, Szeged

slide20

Oligonukleotidalapú chip készítése 1.

szintetikus oligonukleotidok

kémiai kikötése

slide21

CHIPKÉSZÍTÉS

Oligonukleotidalapú chip készítése 2.

in situ szintézis

Affymetrix

DNA-chip Lab.BRC, Szeged

slide22

Multiplex in situ custom DNA synthesis

  • 1k and 10k features available

Semi conductor Microarrays

1. Semiconductor Base

2. Scalable Density

3. Active Device - Computer Controlled Electro-Chemistry

slide25

1024 Features

13,416 Features

1K

10K

Scalable Technology Platform

slide26

Nagyobb DNS molekulák

pl. PCR- felskszorozott cDNS klónok

kovalens kikötése aktivált tárgylemezre

DNA-chip Lab.BRC, Szeged

slide28

mRNS

T

DNS-chipek

Transzkriptom

Mutációk,

Egy nukleotid eltérések

(SNP), deléció, inszerció

Gén kifejeződés

megváltozása

AAAAA

AAAAA

Fehérjék

AAAAA

AAAAA

P

Proteom

Kifejeződés,

módosítások,

kölcsönhatások

G

Genom

Fehérje-chipek

Mire alkalmasak a chipek?

DNA-chip Lab.BRC, Szeged

slide29

1. SNP

3 pozíció

2. SNP

2 pozíció

hibridizáció

A

G

T

C

mosás

A

G

T

C

Pontmutációk (SNP) detektálása

  • Oligonukleotid
  • alapú chipek
  • egy nukleotid eltérés
  • azonosítása

Jelölt

DNS

DNS

detektálás

Adat analízis

1. SNP: 3. pozíció A-C

2. SNP: 2. pozíció C-T

DNA-chip Lab.BRC, Szeged

slide30

Jelölt

cDNS

hibridizáció

mosás

AAAAA

AAAAA

AAAAA

AAAAA

mRNS

detektálás

biológiai anyag

Génkifejeződés tanulmányozása

– cDNS vagy oligonukleotid chip

– transzkriptom analízise

– aktív-inaktív gének detektálása

– bonyolult adat és statisztikai analízis

aktív gének vizsgálata

  • Adat analízis:
  • relatív aktivitás mérése
  • aszínesseljelölt
  • gének aktívak
  • afeketék nem

DNA-chip Lab.BRC, Szeged

slide31

Jelölt próba készítése:

két különböző minta együttes analízise

kontroll minta (egészséges,

kezeletlen)

sejt vagy szövet

beteg, gyógyszerrel kezelt,

különböző környezeti

hatásoknak kitett

sejt vagy szövet

RNS tisztítás

cDNS írás RNS-ből

(reverz transzkripció)

Cy5 dCTP

Cy3 dCTP

jelölt cDNS

jelölt cDNS

Hibridizáció, mosás

Szkennelés

DNA-chip Lab.BRC, Szeged

slide32

RNS

cDNS

cDNS-chip 4000 különböző

Arabidopsis génmintát tartalmaz

cDNS-chipek alkalmazásai:

(1) szövetspecifikus génexpresszió különbségek vizsgálata

DNA-chip Lab.BRC, Szeged

slide33

Gyógyszer-indukált génexpresszióváltozás vizsgálata

Mycobacterium tuberculosis-ban cDNS-chip technikával

1. cDNS-chip készítése

2. RNS izolálás, és próbakészítés

M. tuberculosis-ból

Kezeletlen, kontroll

baktériumok

Isoniaziddal kezelt

baktériumok

RNS izoláció, jelölt cDNS készítése

Cy3-dUTP és Cy5-dUTP felhasználásával

Reverz transzkripció reakcióban.

3,834 ORF (össz. becsült ORF 97%-a)

PCR génspecifikus primerekkel,

tisztítás és felvitel poli-L-lizinnel bevont

mikroszkóplemezekre robot segítségével

3. Hibridizáció

EREDMÉNYEK:

4. Adatfeldolgozás

- Isoniazid több olyan gént indukált, melyek a gyógyszerhatás

mechanizmusával kapcsolatos fehérjéket kódolnak:

II-es típusú zsírsavszintetázt, trehalóz dimikolil transzferázt.

- további indukált gének: valószínűleg a gyógyszer toxikus

hatásával magyarázható általános hatás miatt

- egy új efflux proteint kódoló gén indukcióját is megfigyelték

Az eredmények olyan információkat szolgáltathatnak, melyek

gyógyszer hatásmechanizmusokat, új targeteket tárhatnak fel.

PNAS (1999) 96, 12833-12838

slide34

RNS

cDNS

cDNS-chip 6000 különböző

egyedi egér génmintát tartalmaz

cDNS-chipek alkalmazásai: (2) eltérő állapotokért felelős génexpresszió

különbségek vizsgálata

Új gének azonosítása

Génfunkciók jellemzése

Génkölcsönhatások megértése

Differenciáció tanulmányozása

Tumorképződés vizsgálata

Gyógyszerek felfedezése

DNA-chip Lab.BRC, Szeged

slide35

Egészséges ésdagantos(HBL100 vs. breast carcinoma BT474) szövetek génkifejeződéseinek összehasonlítása

DNA-chip Lab.BRC, Szeged

slide36

Paraffinba ágyazott minták

normál daganat

Génátrendeződési arányok

9

4

Metasztázisok, tumorok, multiplex tumorok jellemzése, igazolása

-1

DNS

-6

PCR

agy génarány

Tüdő génarány

-11

-16

12 q

03 q

12 p13

17 p13

08 p23

09 p13

11q23

17 p13

18 q21.3

19 p13.2

19 p13.2

19 q13.4

19 q13.4

21 q22.1

22 q13.1

01 q21

02 q13

06 q27

07 p21.3

09 q21.2

10 p11.2

13 q32.2

16 q23.1

19 q13.12

19 q13.43

20 q11.22

20 q13.33

01 p34.2

01 q21.1

01 q21.3

03 p21.3

04 p16.3

06 p21.3

01 p36.31

06 p21.31

03 p21.1-9

09 p12-13.3

14 q24-q31

09 q32-q33.3

01 p13-p21

01 q24-q25

01 q31-q32

02 p13-p12

02 q34-q35

01 p12-13.3

01 p33-34.2

01 q21.2-22

Xp11.3-p11.23

18 p11.1-q11.2

08 q21.2-q21.3

03 q21.1-q21.2

07 p15.3-7p14

Genomszintű változások,

kromoszóma rendellenességek,

amplifikációk, deléciók detektálása

slide37

Képanalízis

Lézer szkenner

Cy5

Lézer szkenner

Cy3

kontroll minta (egészséges,

kezeletlen)

sejt vagy szövet

beteg, gyógyszerrel kezelt,

különböző környezeti

hatásoknak kitett

sejt vagy szövet

Cy3 dCTP

Cy5 dCTP

jelölt cDNS

jelölt cDNS

slide38

?

Nem szignifikáns

adatok

ADATFELDOLGOZÁS

„Árnyékzóna”

slide39

Cy-3, Cy-5 jelek kvantitatív összehasonlítása

Quantarray szoftverrel (GSI Lumonics)

Arány és intenzitás

megszorítások nélkül

Arány és intenzitás

megszorításokkal

DNA-chip Laboratory, BRC, Szeged

slide41

Adatfeldolgozás, statisztikai analízis

R1=(CH1I-CH1Bk)/(CH2I-CH2Bk)

R1M=IF(CHB1<0.55,"",IF(CHB2<0.55,"",IF(FLAG=1,"",R1)))

R1MN=IF(R1M="","",R1M/NoF)

R1MNA=IF(R1MN="","",IF(R1MNx="","",IF(RMN1Rep>=RMN1x,

IF(RMN1Rep/RMN1x<2,(RMN1x+RMN1x)/2,""),IF(RMN1x/RMN1Rep<2,

(RMN1Rep+RMN1x)/2,""))))

slide45

Leukémiák molekuláris

osztályozása

génexpresszió monitorozással

DNS-chipek alkalmazásával

- Új alosztályok felfedezése

- Új esetek osztályozása

- Jóslat kemoterápiás kezelés

hatékonyságára

- Atipikus esetek tisztázása

Jövő:

- Tumorminták gyűjtése

- Kemoterápia jellemzése

- Expressziós analízis

- Adatbank létrehozása

- Alosztályok meghatározása

- Kemoterápiára adott válaszok

jellemzése DNS-chipekkel

- hatásmechanizmus feltárása

- rezisztenciáért felelős gének

azonosítása

Science 1999, 286, 531.

slide46

B-sejt limfómák

osztályozása

Alizadeh et al.,

Nature, 2000, 403,

503-511.

slide47

Teszt és általános

gének azonosítása:

1. beteg

cDNS

RNS

CML

hibridizálás

cDNS

2. beteg

RNS

cDNS

x. beteg

RNS

diagnózis

kezelés

korai reakció

RNS

RNS

RNS

RNS

RNS

RNS

RNS

RNS

RNS

RNS

1. típus

tünetmentesség

kontrol

kontrol

kontrol

kontrol

kontrol

kontrol

kontrol

kontrol

kontrol

kontrol

relapszus

2. típus

3. típus

Mintaelőkészítés, csoportosítások terve

krónikus mieloid leukémiák osztályozásához

Későbbi

kimenetel

slide48

Génexpressziós klaszterek patkány fejlődése során

The time of birth is marked by a vertical line

a. Normalized gene-expression trajectories are shown grouped by waves that are determined by clustering. The graphs below

show the average normalized expression pattern or wave over the nine time points for all of the genes in each cluster.

b. Tree of all gene-expression pattern. c. Plots of all normalized time series, highlighted wave 3.

DNA-chip Laboratory, BRC, Szeged

slide49

Dataprocessing and visualization

Sejtosztódást gátló, apoptózist serkentő vegyület

hatásának vizsgálata 3 sejttenyészeten 2 különböző

koncentrációban humán cDNS-chippel

Repression of cell division

Imaging: „tree” & „galaxis”

clastering methods