Lékařská mykologie (Bi3390) Chromomykózy Eumykotický mycetom Molekulární metody identifikece

1. MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮ http://www.sci.muni.cz/ccm Lékařská mykologie (Bi3390)Chromomykózy Eumykotický mycetomMolekulární metody identifikece

2. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Chromomykózy chromomykózy (chromoblastomykózy) – hnědě pigmentovaná sklerotická tělíska v postižené kožní či podkožní tkáni Phialophora verrucosa, Fonsecaea pedrosoi, Fonsecaea monophora a Cladophialophora carrionii chromomykózaruky, původceCladophialophora carrionii http://www.mycology.adelaide.edu.au/Mycoses/Subcutaneous/Chromoblastomycosis/index.html

3. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Chromomykózy - diagnostika diagnostika – kožní stěry, biopsie kožní stěry – louhový preparát (Parker, Calcofluor) tkáně – barvení HE, PAS, stříbření dle Grocota kultivační průkaz, Sabouraudův glukózový agar kožní stěr – barvení Parker, sklerotická tělíska sklerotická tělíska ve tkáni, barvení HE http://www.mycology.adelaide.edu.au/Mycoses/Subcutaneous/Chromoblastomycosis/index.html

4. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Eumykotický mycetom ohraničená granulomatózní infekce kůže nebo podkoží, výjimečně i kosti hnis z mycetomu obsahuje zrníčka složená ze spleti vláken Madurella, Acremonium, Pseudallescheria, Exophiala, Leptosphaeria, Curvularia, Fusarium, Aspergillus atd.

5. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Eumykotický mycetom - diagnostika biopsie tkání tkáně – barvení HE, PAS, stříbření dle Grocota průkaz přítomnosti bílých až žlutých nebo černých pigmentových zrn kultivační průkaz, Sabouraudův glukózový agar barvení HE, mycetom, původce Madurella mycetomatis http://www.mycology.adelaide.edu.au/Mycoses/Subcutaneous/Mycetoma/index.html

6. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Chromomykózy a eumykotický mycetom Cladophialophora Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Chaetothyriomycetidae, Chaetothyriales, Herpotrichiellaceae Cladophialophora bantiana – původce feohyfomykózy v podobě solitárních abscesů situovaných v CNS (biohazard 3) Cladophialophora carrionii – původce mycetomu a chromomykózy v zemích Jižní Ameriky původně klasifikovány v rodech Cladosporium a Xylohypha od rodu Cladosporium se liší málo diferencovanými konidiofory a nepigmentovanými jizvami po oddělení konidií Cladophialophora bantiana http://www.mold.ph/cladophialophora.htm

7. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Chromomykózy a eumykotický mycetom Cladophialophora bantiana synonyma: Xylohypha bantiana; Cladosporium bantianum; Cladosporium trichoides v přírodě izolován z půdy kolonie sametové, olivově zelené, reverz olivově černý roste ve 40°C olivové konidie v dlouhých, málo větvených řetízcích, příležitostně přítomny velké chlamydospory http://www.pf.chiba-u.ac.jp/gallery/fungi/c/Cladophialophora_bantiana_colony-2%20.htm http://www.mycobank.org/Biolomics.aspx?Table=Mycobank&Page=200&ViewMode=Basic

8. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Chromomykózy a eumykotický mycetom Cladophialophora bantiana http://www.doctorfungus.org/thefungi/img/cla1_l.jpg

9. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Chromomykózy a eumykotický mycetom Cladophialophora carrionii synonymum Cladosporium carrionii v přírodě izolován z půdy kolonie práškovité, olivově zelené, reverz olivově černý neroste při teplotách nad 35-36 ° C olivově zelené, apikálně větvené konidiofory nesoucí řetízky konidií http://www.microbiologybook.org/mycology/Cladosporium.jpg http://www.mycobank.org/Biolomics.aspx?Table=Mycobank&Page=200&ViewMode=Basic

10. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Chromomykózy a eumykotický mycetom Cladophialophora carrionii http://www.doctorfungus.org/thefungi/Cladophialophora.php

11. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Chromomykózy a eumykotický mycetom Phialophora Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Chaetothyriomycetidae, Chaetothyriales, Herpotrichiellaceae, Phialophora verrucosa kolonie pomalu rostoucí, olivové až černé fialidy ampuliformní s výrazným nálevkovitým, tmavě pigmentovaným límečkem konidie eliptické, hladké, hyalinní, ve shlucích v přírodě se nachází na rostlinných zbytcích, v půdě, exkrementech http://www.mycobank.org/Biolomics.aspx?Table=Mycobank&Page=200&ViewMode=Basic http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Conidia-laden_conidiophores_of_Phialophora_verrucosa_PHIL_4238_lores.jpg

12. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Chromomykózy Fonsecaea Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Chaetothyriomycetidae, Chaetothyriales, Herpotrichiellaceae Fonsecaea pedrosoiaFonsecaea monophora melanizované konidiofory s tupými výběžky nesoucími konidie jednotlivě nebo v krátkých řetízcích, které se mohou větvit oba druhy jsou morfologicky velmi podobné a rozlišitelné pomocí genetických metod rostou ve 37°C , ale nerostou při 40°C kolonie pomalu rostoucí, olivové až černé, reverz černý oba druhy jsou půdní saprofyté a F. pedrosoi je také spojován s rozkladem lesního opadu http://www.doctorfungus.org/thefungi/Fonsecaea.php

13. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Chromomykózy Fonsecaea pedrosoi melanizované konidiofory se shluky krátkých tupých výběžků konidie světle olivové, v krátkých řetízcích ampuliformní, tmavě pigmentované fialidy s výrazným nálevkovitým límečkem http://www.pf.chiba-u.ac.jp/gallery/fungi/f/Fonsecaea_pedrosoi_microscopy2.htm http://www.mycobank.org/BioloMICS.aspx?Table=Mycobank&Rec=29711&Fields=All

14. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Eumykotický mycetom Madurella Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Sordariomycetes, Sordariomycetidae, Sordariales Madurella grisea, Madurella mycetomatis kolonie pomalu rostoucí, melanizované, většinou sterilní mycelium M. grisea – neroste ve 37°C, M. mycetomatis – roste ve 37°C M. mycetomatis – mohou být přítomny fialidy s drobnými konidiemi v krátkých řetízcích Madurella mycetomatis http://www.mycobank.org/BioloMICS.aspx?Table=Mycobank&Rec=14825&Fields=All http://www.mycology.adelaide.edu.au/Fungal_Descriptions/Hyphomycetes_%28hyaline%29/Madurella/mycetomatis.html

15. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Eumykotický mycetom Exophiala Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Chaetothyriomycetidae, Chaetothyriales, Herpotrichiellaceae v prostředí na tlejícím dřevě, v půdě Exophiala jeanselmei, Exophiala moniliae a Exophiala spinifera – patogeni mycetom (E.jeanselmei ), chromomykózy, feohyfomykózy černý kvasinkovitý organizmus charakteristický annelidickou konidiogenezí kolonie mají ve středu kvasinkovitý vzhled, později sametové až lanózní, olivové až černé Exophiala jeanselmei http://www.mycology.adelaide.edu.au/Fungal_Descriptions/Hyphomycetes_%28dematiaceous%29/Exophiala/

16. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Eumykotický mycetom Exophiala Fungi, Ascomycota, Pezizomycotina, Eurotiomycetes, Chaetothyriomycetidae, Chaetothyriales, Herpotrichiellaceae v mladé kultuře – řetízky kulovitých, pučících, kvasinkovitých buněk ve starší kultuře – přehrádkované hyfy nesoucí konidiogenní buňky (anelidy – s velice krátkou anelidickou zónou) konidie eliptické, obvykle jednobuněčné, ve shlucích torulózní hyfy v infikované tkáni se nacházejí tmavě pigmentované hyfy a kvasinkovité buňky http://www.doctorfungus.org/thefungi/Exophiala.php http://www.mycobank.org/BioloMICS.aspx?Table=Mycobank&Rec=46560&Fields=All

17. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Detekce a identifikace původců mykotických infekcí pomocí metod molekulární genetiky metody molekulární diagnostiky jsou založeny převážně na PCR umožňují detekovat i malé množství DNA chybí mezilaboratorní standardizace, proto nejsou zahrnuta mezi kritérii EORTC/MSG pro stanovení diagnózy IFD u onkologických pacientů efektivita detekce mikromycet pomocí PCR je limitována procedurou izolace nikoliv vlastní reakcí EORTC – skupina pro infekční nemoci Evropská organizace pro výzkum a léčbu rakoviny MSG – skupina pro studium mykóz Národního ústavu alergie a infekčních nemocí v USA IFD (invasive fungal diseases) - invazivní mykotická onemocnění

18. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Detekce a identifikace původců mykotických infekcí pomocí metod molekulární genetiky Izolace DNA zvolená metoda izolace musí být natolik účinná, aby dokázala rozrušit vysoce odolnou buněčnou stěnu mikromycet zamezení možnosti kontaminace vzorku mikromycetami z prostředí a samozřejmě také případné cross-kontaminaci mezi jednotlivými vzorky navzájem - negativní kontrola při PCR a při izolaci doporučuje se mechanická lýza (rozbití buněk vortexováním vzorku se skleněnými kuličkami) – rychlejší proces než enzymatická lýza kit pro izolaci DNA z tkání (DNeasy Tissue Kit, Qiagen), obsahuje účinnější lyzační roztoky než běžné komerční kity. Používá se v kombinaci s mražením v tekutém dusíku a vařením nebo inkubací vzorku v lyzačním roztoku přes noc v kombinaci s mechanickou lýzou DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)

19. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Detekce a identifikace původců mykotických infekcí pomocí metod molekulární genetiky Pro rutinní laboratorní diagnostiku musí být provedeno testování metod PCR na: analytickou specifitu – ověření, zda metoda nedetekuje sekvence DNA jiných druhů organizmů, než pro které byly navrženy (primery do konzervativních úseků genomu mohou nasedat na lidskou DNA) analytickou senzitivitu – nejmenší množství DNA, které metoda reprodukovatelně zachytí (limit detekce)

20. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Dělení diagnostických metod založených na PCR Podle spektra detekovaných patogenů - je dáno primery použitými při PCR specifické nespecifické (panfungální) primery zacílené do variabilních oblastí je možné pomocí PCR detekovat druh či rod primery zacílené do konzervativních oblastí budou amplifikovat DNA u velkého počtu houbových druhů – značí přítomnost jakéhokoliv z těchto druhů pro přesnější určení je možné využít sekvenování DNA

21. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Dělení diagnostických metod založených na PCR Podle toho, zda je zjišťováno množství DNA ve vzorku kvalitativní – neposkytují informaci o množství DNA (výsledek pozitivní/negativní) kvantitativní (qPCR) – detekují množství amplifikované DNA nejčastěji používaná – kvantitativní PCR v reálném čase (RQ-PCR) a její modifikace RQ-PCR umožňuje sledování množství přibývajícího produktu v průběhu reakce a zpětné odvození množství DNA na počátku (množství houbového patogena ve vzorku) odlišení infekce od kolonizace či kontaminace

22. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Detekce a identifikace původců mykotických infekcí pomocí metod molekulární genetiky Vyšetřované klinické vzorky primárně sterilní – krev, mozkomíšní mok, vzorky tkáně z biopsie primárně nesterilní – tekutina z bronchoalveolární laváže, sputum, tkáň z pitvy

23. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Detekce a identifikace původců mykotických infekcí pomocí metod molekulární genetiky Hodnocení PCR produktu výsledek kvalitativní PCR se obvykle hodnotí pomocí gelové elektroforézy a značením produktu PCR fluorescenčním barvivem (např. ethidiumbromid, GelRed) gelová elektroforéza - separace molekul DNA různé délky a určení jejich přibližné velikosti přečištění PCR produktu od PCR reagencií měření koncentrace 600 pb

24. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Detekce a identifikace původců mykotických infekcí pomocí metod molekulární genetiky HRMA analýza křivek tání s vysokým rozlišením využívá rozdílné teploty tání různých molekul DNA (produktů PCR) teplota tání závisí na délce produktu a obsahu nukleotidivých párů CG průkaz mukoromykózy a identifikace původce HRMA trvá 30 minut a je prováděna jako další krok na stejném přístroji, kde proběhla RQ-PCR

25. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Detekce a identifikace původců mykotických infekcí pomocí metod molekulární genetiky Volba cílového genu pro PCR při detekci mykotických patogenů jsou používány rozličné cílové geny nebo jejich části určování organizmů pomocí krátkých, druhově jedinečných sekvencí DNA „barcoding DNA“ který gen použít pro druhovou identifikaci DNA? gen pro mitochondriální cytochromoxidázu 1 (CO1), používaný u živočichů není pro houby příliš vhodný délka tohoto genu se u hub pohybuje mezi 1,5-22 kilobázemi DNA kvůli přítomnosti intronů nelze rozlišit blízce příbuzné druhy v databázi málo houbových sekvencí CO1

26. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Detekce a identifikace původců mykotických infekcí pomocí metod molekulární genetiky Volba cílového genu pro PCR jaderné geny pro ribozomální RNA (rRNA, v literatuře rDNA) skupina genů pro rRNA (multikopiové geny) se v genomu vyskytuje v několika desítkách kopiích (snadná amplifikace PCR z materiálu s malou fungální náloží) schéma části genu pro ribozomální RNA kódující podjednotky:18S (malá podjednotka SSU), 5,8S a 28S (velká podjednotka LSU) podjednotky jsou odděleny dvěma mezerníky ITS1 a ITS2 http://biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm http://zdravi.e15.cz/clanek/postgradualni-medicina-priloha/molekularnebiologicka-mykotickych-infekci-diagnostika-invazivnich-vlaknitymi-houbami-vyvolanych-vzacnymi-448249

27. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Detekce a identifikace původců mykotických infekcí pomocí metod molekulární genetiky Volba cílového genu pro PCR sekvence ITS - univerzální marker pro „barcoding“ hub - jsou dosti variabilní, probíhají v nich rychleji evoluční změny - možnost použití panfungálních primerů u různých skupin mikromycetů - široká veřejná databáze sekvencí u evolučně mladších taxonomických skupin nejsou sekvence ITS dostatečně variabilní pro rozlišení blízce příbuzných druhů –použití několika různých genů, které poskytnou více informací používají se jaderné geny pro proteiny: beta-tubulin, kalmodulin, podjednotky polymerázy II (RPB1, RPB2) – sekvenace fragmentů více genů = multilokusová sekvenční typizace (MLST) analýza mikrosatelitů – krátké opakující se sekvence DNA vyskytující se na různých místech genomu a vyznačující se značnou variabilitou v počtu repetic

28. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Cílové geny použity v publikovaných studiích při detekci mykotických patogenů Zdroj: Detekce a identifikace původců mykotických infekcí způsobených vláknitými houbami pomocí metod molekulární genetiky. P. Bejdák, M. Lengerová, D. Paloušová, P. Volfová, I. Kocmanová, J. Mayer, Z. Ráčil, Klinická mikrobiologie a infekční lékařství. 2012, roč. 18, č. 4, s. 109-114.

29. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Detekce a identifikace původců mykotických infekcí pomocí metod molekulární genetiky Sekvenování DNA v kombinaci s panfungální PCR sekvenuje se produkt PCR - primery jsou umístěny v konzervativních oblastech a mezi nimi leží variabilní sekvence, které se při PCR amplifikují získané sekvence umožňují druhovou identifikaci použitý úsek DNA se může lišit jen několika nukleotidy – důležitá kontrola a případná oprava chyby komplikace sekvenční genetické analýzy – vorek obsahuje více druhů (kolonizace nebo kontaminace primárně nesteriliního vzorku) vzniká směs PCR produktů, pokud mají podobnou délku, nelze je rozlišit gelovou elektroforézou a výsledkem sekvenování je směsný signál separace molekul DNA různé délky pomocí klonování produktů PCR do bakterií a následně sekvenace jednotlivé bakteriální kolonie obsahující jen jednu variantu původního produktu – finančně a časově náročné

30. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Detekce a identifikace původců mykotických infekcí pomocí metod molekulární genetiky Sekvenování DNA program Chromas Lite – zobrazovací program sekvencí zhodnotí se začátek a konec sekvence, odstraní se nespolehlivě sekvenované báze (ze začátku sekvence se ořezává přibližně 10 – 40 bp, z konce sekvence podle potřeby i několik desítek bp

31. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Detekce a identifikace původců mykotických infekcí pomocí metod molekulární genetiky Sekvenování DNA formát FASTA >gi|478427411|gb|KC456184.1| Aspergillus fumigatus strain C2 internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene, complete sequence; and internal transcribed spacer 2, partial sequence CAACCTCCCACCCGTGTCTATCGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGTTTCGACGGCCGCCGGGGAG GCCTTGCGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACCCCAACATGAACGCTGTTCTGAAAGTATGCAGTCTG AGTTGATTATCGTAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCA GCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCC CCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGC CCCCGTCCCCCTCTCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCGCCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTAT GGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCCGGCCGACACCCAACCAA >F-10410_ITS5 sequence exported from F-10410_ITS5.scf GCGGATGGTGACGCGGAGGGATCATTACAGAGTTGTAAAACTCCCAAACCCATGTGAACA TACCTGTTGCCTCGGCGGCCTACCCGGCAGCTACCCTGTAGCTACCCTGTAGTCCGCCGA CGGATCTCAAAACTCTTGTTTTCAGTTGTATCTCTGAGAATAAAACAAATAAATCAAAAC TTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGT AATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAG TATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTAAGTCCACTTAAGCCCTGCTTAGTGTT GGGAGACTGCTCCAGCGGTGCTACCCTGTAGCTACCCTGCAGCTCCTCAAAGACAGCGGC GGAGTTGTGGTATCCTCTGAGCTTAGTAACTTGTTCTAGCTTTCGAGTACACCACTTCCC CTGCCGTAAAACCCTTAATTTTTAATGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGA ACTTAAGCATATCAATAGCCGGGAGGAACACCTGTAATCGGGGGGGAAATCCCGTTTATT TACCCATTCTATAACAGCGGAGAGAACCTCTTCTGCAGTTCCGGATTAC

32. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Detekce a identifikace původců mykotických infekcí pomocí metod molekulární genetiky Databáze sekvencí GenBank jejíž součástí je program pro párové seřazení sekvencí BLAST – vyhledá v databázi podobné sekvence http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome

33. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Detekce a identifikace původců mykotických infekcí pomocí metod molekulární genetiky BLAST „Max ident“ – procentuální vyjádření podobnosti zadané sekvence s těmi v databázi „Query coverage“ – informace jaký úsek zadané sekvence se shoduje s nalezenými včetně grafického znázornění z těchto údajů se počítá skóre a podle jeho hodnot jsou seřazeny výsledky počínaje těmi s největší shodou

34. ČESKÁ SBÍRKA MIKROORGANISMŮhttp://www.sci.muni.cz/ccm Detekce a identifikace původců mykotockých infekcí pomocí metod molekulární genetiky Specializované databáze sekvencí obsahují méně záznamů, ale podléhají přísnější kontrole kvality databáze CBS http://www.cbs.knaw.nl/ (Database) Fungal Barcoding Database http://www.fungalbarcoding.org/ (Identification)