S TEM C ELL D IVISION IS R EGULATED BY THE M ICRO R NA P ATHWAY

1. MATHEUS ANDRADE RAJÃO STEM CELL DIVISIONIS REGULATED BY THE MICRORNA PATHWAY S. D. Hatfield, H. R. Shcherbata, K. A. Fischer, K. Nakahara, R. W. Carthew and H. Ruohola-Baker NATURE 2005

2. Introducão Dicer MicroRNAs e siRNA Silenciamento

3. Introducão - Repressão gênica via microRNA: • Havia registros anteriores de miRNA diferencialmente expressos em células tronco • Sugeriu-se então que miRNAs poderiam ter um papel na regulação • do caráter tronco

4. Experimento Como testar ??? Inibir a via de miRNA Processamento de miRNA dicer 1 Drosophila melanogaster dicer 2 Processamento de siRNA Elimina miRNA Pouco efeito em siRNA Proposta: eliminar dicer 1

5. Experimento Células tronco da linhagem germinativa (GSC) Ovário de Drosophila • Se renovam • Divisões geram câmaras de células • Que se diferenciam em blastocistos

6. Experimento 1 - Analisar se a ausência de dcr 1 altera a taxa de divisões celulares Wild Type dcr 1 -

7. Experimento 1 - Vários estágios do desenvolvimento estão faltando nos mutantes em dcr 1 Wild type dcr 1 -

8. Inferências obtidas com o experimento 1 • Dcr 1 mutante X heterozigoto Dicer 1 requerida para produção de linhagem germinativa Pouco desenvolvimento das câmaras - Dcr 2 mutante X heterozigoto (data not shown) Indica a participação de somente miRNA, e não siRNA Desenvolvimento normal das câmaras

9. Experimento 2 A GSC está boa? Está ruim? Manutenção Divisão Identidade

10. Experimento 2 Marcadores de localização e de padrões de expressão Confirmar a identidade de GSC, e se ela está no lugar certo

11. Experimento 2 Presença de espectrassomo confirmada dcr 1 - (sem GFP)

12. Experimento 2 Marcadores de localização e de padrões de expressão Mad fosforilada: Indica que a sinalização por TGF-beta está funcionando

13. Experimento 2 dcr 1 - Presença de P-Mad confirmada dcr 1 - (sem GFP)

14. Experimento 2 Marcadores de localização e de padrões de expressão A ausência de BamC, causada pela sinalização de TGF-beta

15. Experimento 2 Segundo os autores, a ausência de BamC foi confirmada dcr 1 - (sem GFP)

16. Experimento 3 A GSC está boa? Está ruim? Manutenção Divisão Identidade

17. Experimento 3 Análise da distribuição dos estágios do ciclo celular nas GSCs mutantes Corando o ovário com anticorpos específicos para diferentes marcadores celulares

18. Experimento 3 Porém apresentam os outros marcadores em concentrações iguais ou reduzidas Os mutantes em dcr-1 apresentaram um acúmulo de CycE

19. Experimento 3 Isso sugere que os mutantes estão parando a divisão na transição entre G1 e S dcr 1 - (sem GFP)

20. Experimento 3 E em machos? Será que a ausência de dicer 1 provoca conseqüências similares? Cada testículo contém aproximadamente 10 GSCs circundando uma estrutura chamada “hub”

21. Experimento 3 Esses dados mostram que em machos a dicer funciona semelhantemente, sugerindo que ela possui um papel conservado, na evolução, na divisão de GSCs Hub

22. Experimento 4 Será que a via de miRNA regula o ciclo celular de outros tipos celulares? Em outros tipos celulares não se observou o acúmulo de CycE. (data not shown) Dessa forma, a via de miRNA se mostra específica para células tronco

23. Experimento 5 Será que a parada em G1/S estaria ligada à Dacapo (homólogo de p21/p27, inibidores de CDKs)? Dacapo sequestra CycE/CDK2 em um complexo estável e inativo, travando o ciclo em G1/S, com uma expressão prolongada de CycE Mutantes apresentaram mais GSCs coradas para Dacapo

24. Experimento 5 E se diminuirmos a expressão de Dacapo? O que acontece? Os níveis de CycE voltaram aos níveis normais

25. Experimento 5 - Ao que tudo indica, miRNA atua na célula tronco diminuindo os níveis de Dap - Como isso é feito?

26. Conclusões - Propôs-se então um mecanismo da via de miRNA que regula a divisão em células tronco