Seminario de Microbiología “Estructura y función de proteínas de la división celular”

1. Seminario de Microbiología “Estructura y función de proteínas de la división celular” Doctorado en Ciencias Programa Microbiología USACH/UCH David Salvador González Padilla Profesor Coordinador: Octavio Monasterio

2. Antecedentes • Descubrimiento Homólogos procariontes de proteínas citoesqueleto eucarionte • Lutkenhaus 1980 • Matsuhashi 1988 • ACTINA • TUBULINA • FILAMENTOS INTERMEDIOS • Funciones del citoesqueleto bacteriano • - Rigidez de las membranas • - Forma celular • - División celular • - Movimiento de estructuras subcelulares dentro de la célula

3. Antecedentes • Proteínas citoesqueleto Eucarionte • Tubulina: forma microtúbulos (filamentos rectos y huecos). Heterodímeros a y b. Hidrolizan GTP. Tienen crecimiento polarizado (extremos +/-) . Son elementos dinámicos. • Huso mitótico, segregación de los cromosomas • Transporte de vesículas • Actina: forma filamentos helicoidales • Dos cadenas enrolladas. Hidroliza ATP, elemento dinámico (extremos +/-) • Movimiento pseudópodos • Tráfico vesicular • Filamentos Intermedios: formados por proteinas coiled-coil extendidas. • Soporte mecánico para la célula. Sábanas rígidas • Mucho menos conservada que otros elementos citoesqueleto

5. Homólogos de Tubulina • FtsZ: forma un anillo en el medio de la célula en división (Z ring) • La localización de todas las proteínas del divisoma bacteriano es dependiente de FtsZ • El gen ftsZ está presente en casi todas las bacterias y archeas conocidas, a excepcion de sulfolobus • No tiene el dominio C terminal de Tubulina • Tienen 2 dominios, unos de los cuales esta relacionado con actividad GTPasica • El GTP se une entre los 2 dominios • Estabilizado por FtsA y ZipA • Inhibido pr MinCDE y SulA • BtubA/B:solo ha sido descrita en el género Prostheobacter, división Verrumicrobia. BtubA/B copolimeriza en presencia de GTP formando un protofilamento de doble hélice. • En P. dejongeii no se ha encontrado un gen equivalente a FtsZ • Tiene el dominio C terminal de tubulina

6. Esquema del Sistema MinCDE

7. Homólogos de Actina • FtsA: interactúa con el extremo C terminal de FtsZ • in vitro forma largos polímeros curvados en presencia de varios nucleótidos di/trifosfato, pero generalmente une ATP, aunque la actividad ATPásica solo ha sido descrita en B. subtilis. • El ensamblaje de los componentes tardíos del divisoma es, a su vez, dependiente de la presencia de FtsA y existen evidencias genéticas sugieren que FtsA interactúa con FtsI y que la localización en el anillo del divisoma de FtsK, FtsL, FtsN y FtsQ es dependiente de su presencia

8. Homólogos de Actina • MreB: En E. coli se ha descrito una sola proteína, en cambio en B. subtilis existen 2 o más proteínas relacionadas( MreBl - MreBH) • Se organizan en filamentos helicoidales bajo la superficie de la membrana plasmática. Cada filamento está formado por dos cadenas que interactúan lateralmente. La polimerización se produce tanto en presencia de ATP como GTP. • MreB no realiza una función esencial en el mantenimiento de la forma celular, ésta restringida por la pared celular de péptidoglicano (A22 droga) • El operón mreB es parte de un cluster de genes involucrados en la síntesis de mureína, implicando una posible relación entre MreB y el exosqueleto de mureína. • Es posible que Mreb y sus homólogos regulen la forma de la célula al organizar las enzimas de biosíntesis de péptidoglicano en un patrón helicoidal que se extiende a lo largo del eje de la célula. • MreC y MreD actuarían como un puente entre MreB y la maquinaria de síntesis de la pared celular

10. Homólogos de Actina • Sistema ParM: implicado en la segregación de plásmidos de copia única • - Polimeriza formando filamentos de doble cadena helicoidal • - A diferencia de MreB no forma sábanas o atados in vitro • - La polimerización es dependiente de ATP • El crecimiento del filamento se produce en ambos extremos • ParR actúa como un puente entre el extremo de un filamento ParM y el DNA plasmidial (iterones) donde se encuentraunidaParC

11. Esquema de sistema ParMRC

12. Homólogos procariontes de Filamentos intermedios Crescentina: es responsable de la forma de “coma” de C. crescentus - Tiene 25% de identidad de secuencia y 40% de similitud con las proteínas de los filamentos intermedios de eucariontes. - In vitro forma largos polímeros que no requieren la presencia de nucleótidos u otros cofactores - Se sugiere que actuaría de manera directa o indirecta en la mantención de la forma de coma de C. crescentus al regular la localización de la maquinaria biosintética de péptidoglicano

13. Comparación estructural de las proteínas del citoesqueleto eucarionte y procarionte

15. Antecedentes • Se cree que tubulina y FtsZ evolucionaron a partir de un ancestro común. • El secuenciamiento génico de P. dejongeii ha revelado a los genes btubA/B, los cuales comparten más similitud de secuencia con los genes eucariontes a/b tubulina que el homólogo bacteriano de ésta, FtsZ . • Se han reportado varios casos de estructuras similares a microtúbulos en bacterias, y los mejores ejemplos han sido estudiado en bacterias perteneciente a la división Verrucomicrobia.

20. Conclusiones • Al expresar BtubA/B de manera bicistrónica se observa que ambas proteínas no forman un complejo fuerte, pudiendo ser purificadas por separado. • BtubA/B polimeriza en presencia de Mg y GTP • BtubA/B son monoméricas a bajas concentraciones (10 uM) y se asocian formando dímeros a concentraciones más altas (50 uM) • La polimerización solo ocurre cuando BtubA/B se encuentran presentes, y la mejor relación es 1:1; lo que indica la formación de un heterodímero. • La polimerización dependiente de GTP es reversible e inducible por GTP.

21. Conclusiones • Los filamentos producidos por BtubA/B no son microtúbulos. Probablemente tienen una estructura conservada entre los protofilamentos de tubulina/FtsZ, demostrada por la medida de 46 A° de longitud de la repetición (Tubulina 40 A° - FtsZ 46 A°) • La estructura cristalizada de BtubA/B es muy similar a la de tubulina, pues mantiene la arquitectura de 3 dominios típicos: • N terminal, unión de nucleótidos • Dominio intermedio de activación de la hidrólisis de nucleótidos • C terminal, ausente en FtsZ • Las diferencias estructurales entre BtubA/B y tubulina son pequeñas, ubicándose principalmente en el loop T7 y el loop M. • BtubA/B no necesita de chaperonas para plegarse

22. Conclusiones • ¿Cómo se puede explicar la pequeña distancia evolutiva entre BtubA/B y tubulina? • Una posibilidad es que BtubA/B y tubulina tengan ancestros comunes en el mismo linaje, lo que implica que Prostheobacter es un organismo que “comparte”, al menos, alguna parte de su genoma con organismos eucariontes. Aunque solo se conoce el 90 % del genoma de Prostheobacter dejongeii otros genes claramente se agrupan con organismos procariontes (16s RNA, MreB) • La evidencia hallada en este trabajo sugiere que la cercana relación entre estas proteínas se debe a una transferencia horizontal de genes , por sobre la idea de que BtubA/B sea un intermediario entre tubulina y FtsZ. En algún punto uno o dos genes de tubulina fueron transferidos a Prostheobacter donde fueron modificados para no formar heterodímeros tan apretados y plegarse sin necesidad de chaperonas.