1 / 22

Testování toxicity průmyslových chemikálií II – senzibilizace kůže a genotoxicita

Testování toxicity průmyslových chemikálií II – senzibilizace kůže a genotoxicita. Průmyslová toxikologie (C867). Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT). Testovací metody. LLNA – Local Lymph Node Assay (Test regionálních mízních uzlin) - OECD 429

kynan
Download Presentation

Testování toxicity průmyslových chemikálií II – senzibilizace kůže a genotoxicita

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Testování toxicity průmyslových chemikálií II – senzibilizace kůže a genotoxicita Průmyslová toxikologie (C867)

  2. Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) Testovací metody • LLNA – Local Lymph Node Assay (Test regionálních mízních uzlin) - OECD 429 • GMPT - Maximalizační test na morčatech - OECD 406

  3. Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) LLNA – OECD 429 • Vyvolání alergické reakce vyžaduje aktivaci a následnou expanzi T-lymfocytů • Střet kůže se senzibilizátorem vyvolá transport antigenů z kůže do lymfatických uzlin • Antigenem řízená aktivace T-lymfocytů má za následek dělení a diferenciaci alergen-specifických T-lymfocytů • Nárůst počtu T-lymfocytů je měřitelným ukazatelem reakce organismu na kontakt s látkou mající senzibilizační potenciále

  4. Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) LLNA – OECD 429 • Pokusná zvířata – samice myší staré 8 – 12 týdnů, kmen BALB/c, NMRI Postup • testovaná látka – 3 různé koncentrace • negativní kontrola – aceton/olivový olej, dimethysulfoxid aj. • pozitivní kontrola - dinitrochlorbenzen aj.

  5. Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) LLNA – OECD 429 DEN 1 – 3 • aplikace test. látky na dorsální stranu obou uší , aplikační objem 25 mLna ucho DEN 6 • aplikace fyziologického roztoku obsahujícího předepsané množství radionuklidu • (3H thymidinnebo 125I deoxyuridin) • 5 hodin po aplikaci utracení zvířat a odběr uzlin

  6. Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) LLNA – OECD 429

  7. Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) LLNA – OECD 429

  8. Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) LLNA – OECD 429 Vyhodnocení • Příprava buněčné suspenze • Měření inkorporované aktivity v dpm Výpočet Indexu stimulace: • průměrná hodnota dpm exponované skupiny/ průměrná hodnota dpm kontrolní skupiny • je-li IS větší nebo roven 3 je látka považována za senzibilizující. • dávková závislost

  9. Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) GMPT - OECD 406 • Indukční fáze: • kontaktem kůže se senzibilizátorem jsou aktivovány T-lymfocyty a dochází k jejich proliferaci (jako u testu LLNA) • Provokační fáze: • opakovaným kontaktem se senzibilizátorem je u zvířete vyvolána alergická reakce – kontaktní dermatitida Pokusná zvířata: • albinotická morčata obou pohlaví, váha 150 – 250 g, kmen BFC, ve studii 30 zvířat (20 exponovaných + 10 kontrolních)

  10. Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) Metodika: • DEN 1 - indukční expozice intradermální • DEN 7- lokální indukce dermální • DEN 21- provokace • DEN 23 a 24 – odečet kožní reakce GMPT - OECD 406 • Vyhodnocení: • 24 a 48 hodin po aplikaci se vyhodnotí kožní reakce (zarudnutí, otok) • Porovnává se reakce kůže exponované testovanou látkou a reakce kůže exponované vehikulem • Pozitivní výsledek = 30% morčat má pozitivní reakci na kůži tj. zarudnutí případně otok

  11. Senzibilizace kůže (alergická kontaktní dermatitida ACT) Porovnání GPMT a LLNA testu GMPT : • Manipulace: holení, injekční aplikace, opakovaná bandáž • Test trvá 25 dní • Výsledek = subjektivní hodnocení LLNA: • Manipulace: přímá aplikace test. látky neinvazivní formou • Test trvá 6 dnů • Výsledek = číslo • U některých látek nelze použít

  12. Genotoxicita • Studie poskytují informace o možných genotoxických vlastnostech látek tj. o schopnosti způsobovat změny genetického materiálu - mutace Rozdělení mutací • genové - změny v molekule DNA • chromozomální - chromozomální aberace (změny struktury a tvaru chromozómu) • genomové - změny v chromozomálním počtu • nechromozomální - mimojaderné

  13. Genotoxicita - testovací metody • Mutagenita - test chromozómových aberací u savčích buněk in vitro • Mutagenita - test chromozómových aberací v kostní dřeni savců in vivo • Mutagenita in vivo mikronukleus test v savčích erytrocytech • Mutagenita-test reverzních mutací u baktérií • Genové mutace-Saccharomyces cerevisiae • Mitotické rekombinace Saccharomyces cerevisiae • Mutagenita-test genových mutací v savčích buňkách in vitro • Poškození DNA reparace- neplánovaná syntéza DNA-savčí buňky in vitro • SCE - výměna sesterských chromatid in vitro • Recesivní letální mutace vázané na pohlaví u Drosophilla melanogaster • Test transformace savčích buněk in vitro • Dominantní letální test u hlodavců

  14. Mutagenita - test reverzních mutací u baktérií – OECD 471 • Detekce genových mutací – mutace v genu pro syntézu aminokyselin His (Trp) • zkouška pro počáteční vyšetření genotoxické aktivity • pět kmenů bakterií je vystaveno působení zkoušené látky za přítomnosti i bez přítomnosti metabolického aktivačního systému • aktivační systém – posmitochondrionální frakce z jater hlodavců ošetřených prostředkem indukujícím enzymy • Kontrola počtu narostlých kolonií po 48-72 hod – porovnání počtu kolonií revertantů (v přítomnosti testované látky) s počtem kolonií spontánních revertantů (NK)

  15. Mutagenita - test chromozómových aberací u savčích buněk in vitro – OECD 473 • Identifikace látek způsobující strukturní chromozomové aberace = změny ve struktuře nebo počtu chromozomů • zjištění možných mutagenů a karcinogenů u savců Základní rozdělení aberací: • Chromatidového typu • Chromozomového typu • Pro test se používají stabilizované buněčné linie, buněčné kmeny nebo primární buněčné kultury

  16. Mutagenita - test chromozómových aberací u savčích buněk in vitro – OECD 473 • Kultury jsou vystaveny zkoušené látce (a to s metabolickou aktivací i bez ní), v předem stanovených intervalech se přidává látka zastavující metafázi (např. Kolchicin) • Hodnocení přítomnosti chromozomových aberací - nejméně 200 mitóz (46±2 centromery) • Stanoven Mitotický index - buňky v metafázi : celkový počet buněk v populaci • Procento aberentních buněk vůči negativní kontrole

  17. Mutagenita - test chromozómových aberací u savčích buněk in vitro – OECD 473 Chromozomový zlom Chromozomové aberace - příklady Prstencový chromozom (kruhový fragment)

  18. Mutagenita - test chromozómových aberací u savčích buněk in vitro – OECD 473 Acentrický fragment Chromozomové aberace - příklady Dicentrický chromozom

  19. Mutagenita – in vivo mikronukleus test v savčích erytrocytech - OECD 474 • Mikronukleus test zjišťuje poškození, jež testovaná látka způsobuje v chromozómech nebo mitotickém aparátu erytroblastů. • Výsledkem cytogenetického poškození je vznik mikrojader – chromozómových fragmentů v erytrocytech a současně změna v poměru zralých a nezralých erytrocytů v kostní dřeni. • Pro tento test existuje in vitro metoda – v současné době je ve fázi schvalování • Metodika in vivo – pokusné zvíře potkan • testovaná látka v 1 – 3 koncentracích • negativní kontrola + pozitivní kontrola • jednorázová aplikace • vyšetření kostní dřeně 24 a 48 hodin po aplikaci

  20. Mutagenita – in vivo mikronukleus test v savčích erytrocytech - OECD 474 Hodnocení kostní dřeně Normochromní erytrocyt: • zralý erytrocyt, barvící se eosinofilně – červenooranžově Polychromní erytrocyt: • nezralý erytrocyt, barvící se bazofilně - šedomodře Mikrojádra: • fragmenty jádra vznikající během dělení buňky z chromozómů opožděných v dělení Hodnocení • poměr zralých a nezralých erytrocytů • přítomnost nezralých erytrocytů s mikrojádry

  21. Mutagenita – in vivo mikronukleus test v savčích erytrocytech - OECD 474 savčí buňky s mikrojádry – in vitro test - příklady

  22. Mutagenita – kometový test (Comet assay)

More Related