slide1 n.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
Vývoj mikrosatelitních markerů (SSR) KBO/125 Jiří Košnar, katedra botaniky PřF JU, 2012 PowerPoint Presentation
Download Presentation
Vývoj mikrosatelitních markerů (SSR) KBO/125 Jiří Košnar, katedra botaniky PřF JU, 2012

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 9

Vývoj mikrosatelitních markerů (SSR) KBO/125 Jiří Košnar, katedra botaniky PřF JU, 2012 - PowerPoint PPT Presentation


  • 93 Views
  • Uploaded on

Vývoj mikrosatelitních markerů (SSR) KBO/125 Jiří Košnar, katedra botaniky PřF JU, 2012 Kurz byl financován z projektu FRVŠ 1904/2012. Jak najít v genomu SSR?. stále obvykle není reálné osekvenovat a projít celý eukar. genom a najít (relativně vzácné) SSR lokusy.

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'Vývoj mikrosatelitních markerů (SSR) KBO/125 Jiří Košnar, katedra botaniky PřF JU, 2012' - kueng


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
slide1

Vývoj mikrosatelitních markerů (SSR)

KBO/125

Jiří Košnar, katedra botaniky PřF JU, 2012

Kurz byl financován z projektu FRVŠ 1904/2012

slide2

Jak najít v genomu SSR?

  • stále obvykle není reálné osekvenovat a projít celý eukar. genom a najít (relativně vzácné) SSR lokusy
  • účinnější je sekvenovat úseky kde se dá předpokládat vyšší výskyt SSR → snaha o vytvoření ´SSR-enriched genomic library´
  • sekvenací fragmentů DNA genom. library
slide3

Vytvoření SSR-enriched genomic library

štěpení genom. DNA na fragmenty, jejich úprava aby šly použít pro běžné molek. metody - PCR amplifikace a sekvenace (~300-1000 bp)

SSR enrichment:pomocí sondy komplementární k určitému SSR motivu se vytáhnou fragmenty obsahující daný SSR motiv

výsledné fragmenty jsou sekvenovány, na základě získaných sekvencí navrženy primery pro daný SSR lokus

slide4

Vytvoření SSR-enriched genomic library

  • štěpení genom. DNA
    • blunt-ends; 16 h inkubace, pak purifikace (PCR Clean-up kit)

← OK

+ restr. enzym

  • ligace: na konce fragmentů navázány ligací krátké dsDNA fragmenty (linkery) s arbitrární sekvencí - umožní pozdější PCR amplifikaci a sekvenaci; 20 h inkubace

dimery linkerů →

+ T4 ligáza, linkery

  • ověření úspěšnosti ligace: PCR, linker použit jako primer, mělo by naamplifikovat smear bez proužku dimerů linkerů
slide5

Vytvoření SSR-enriched genomic library

  • SSR-enrichment - hybridizace:
    • na fragmenty se annealuje sonda (primer) se SSR motivem, která je na 5´ konci značená biotinem; ca 60° - 15 h

teplotní denaturace

+ sonda

slide6

Vytvoření SSR-enriched genomic library

  • SSR-enrichment – streptavidin capture, wash:
    • ke směsi se přidají streptavidin-coated magnetic beads: vážou biotin a navázáním na sondu z roztoku vychytají fragmenty které nesou daný SSR motiv

+ roztok streptavidin-coated beads

separace magnetem

odsátí roztoku

  • magnetické kuličky s cílovými fragmenty se separují pomocí magnet. stojánku, promývají a supernatant se odstraní
  • cílové DNA fragmenty se uvolní TE pufrem (95°), pomnoží pomocí PCR: linker použit jako primer, mělo by naamplifikovat smear fragmentů 300-800 bp→ azpurifikují PCR Clean-Up kitem
slide7

Co dál s SSR-enriched genomic library?

  • klasická sekvenace (Sanger):
    • umožňuje sekvenaci pouze u směsi homogenních molekul
    • knihovnu nutné nejdříve amplifikovat pomocí PCR – primery nasedají na linkery naligované na koncích fragmentů
    • PCR produkt klonován, aby se separovaly jednotlivé molekuly PCR produktu, a klony potom sekvenovány – finančně extrémně náročné!
    • obvykle pouze 5-10% fragmentů opravdu nese SSR!!!
    • př.: nutné sekvenovat ca 100-200 klonů pro získání 10 SSR lokusů =14-28 tis. Kč
      • možná úspora: selekce klonů pomocí Southern blottu – jako sonda použitý opět daný SSR motiv; sekvenovány pouze klony u nichž blotting opravdu prokáže přítomnost SSR
slide8

Co dál s SSR-enriched genomic library?

  • 454 pyrosequencing
    • umožňuje i sekvenaci směsi heterogenních

molekul (není nutné klonování)

1 molecule → 1 sequencing read

1 sample: min. 5,000-8,000 seq. reads / 2500 Kč(vlastní cena chemikálií, u komerčních firem několikrát víc)

    • nevýhody:
      • kratší délka 454 sekvencí (<550 bp) → riziko že se nepodaří najít vhodná místa pro primery → redukuje počet reálných SSR lokusů
      • minimální cena 1 runu je ca 30 tis. Kč (= vyplatí se multiplexovat víc vzorků, v jednom runu možné kombinovat až 12 vz., tj. náklady na 1 vzorek ca 2500 Kč)
slide9

Praktika

Mikrosat. praktika, 16.-20.4. + 14.-18.5.

  • restrikce genomové DNA
  • ligace adaptorů
  • hybridizace daného SSR motivu (motivů)
  • amplifikace a purifikace enriched SSR library

454 sekvenování na GS Junior (Roche/454), ~ konec května:

  • sekvenace vytvořené SSR library, 2 dny pipetování (+ 3. den stažení dat z přístroje)