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第六章 蛋白印记 ( Western blotting )

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kioko
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第六章 蛋白印记 ( Western blotting )

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  1. 第六章 蛋白印记 (Western blotting)

  2. 一、实验目的熟悉免疫印迹的原理和用途,学习免疫印记的操作技术和结果判定方法。一、实验目的熟悉免疫印迹的原理和用途,学习免疫印记的操作技术和结果判定方法。

  3. 二、原理印迹法:将生物大分子物质通过不同的途径转移到固相载体上,转移后的固相载体经淬灭试剂处理后,用适当的溶液漂洗,置于含底物或探针的溶液中孵育,可与对于的探针反应,显出特异条带。二、原理印迹法:将生物大分子物质通过不同的途径转移到固相载体上,转移后的固相载体经淬灭试剂处理后,用适当的溶液漂洗,置于含底物或探针的溶液中孵育,可与对于的探针反应,显出特异条带。

  4. 二、原理常见的印记法有Southern、Northern、Western印迹法,分别用于检测DNA、RNA和蛋白质。 其中Western印记又称为免疫印迹。

  5. 二、原理 其中,免疫印迹的基本原理是将凝胶电泳与固相免疫相结合,其主要的操作分为三个过程:

  6. 二、原理1)电泳:SDS-PAGE分离各蛋白组分;2)印记:将蛋白质从凝胶转移到固相载体;3)免疫检测:依次与一级抗体和标记的二抗体反应,通过底物或激发光激发显色,观察目的条带的有无。二、原理1)电泳:SDS-PAGE分离各蛋白组分;2)印记:将蛋白质从凝胶转移到固相载体;3)免疫检测:依次与一级抗体和标记的二抗体反应,通过底物或激发光激发显色,观察目的条带的有无。

  7. 二、原理 制备gel 处理Sample 实验流程: Loading sample SDS-PAGE Gel转印硝酸纤维素膜 将gel移入staining solution Western blotting HRP detection destaining solution 直到染色对比清晰为止 Data判读 Data判读

  8. Stacking gel 5% Acrylamide ( Tris-HCl, pH6.8) Separating gel 12 % Acrylamide (Tris-HCl, pH8.8) Running buffer : Tris-HCl, glycine, pH 8.3 二、原理 Discontinuous Gel Electrophoresis

  9. 二、原理 转印及免疫染色流程: 转印三明治 免疫染色流程及结果 塑料夹板 转印 抗体 定性滤纸 HRP-二抗 黑色 透明 转印滤膜 NC膜 海绵垫 显色

  10. 二、原理优点:SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性。用途:常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。二、原理优点:SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性。用途:常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。

  11. 二、原理不足:操作要求高 成本高 结果判断主要依据条带的有无以及条带的亮度

  12. 二、原理 本次实验以APP分泌性蛋白和菌体蛋白为检测抗原,通过免疫印迹方法初步了解免疫血清中针对APP的抗体种类及含量。

  13. 三、材料1.待检抗原:APP分泌性蛋白和菌体蛋白 2.SDS-PAGE凝胶3.1×Tris-Gly电泳缓冲液4.预染蛋白质Marker 5.考马斯蓝染色液

  14. 三、材料6.考马斯蓝脱色液7.转印缓冲液8.硝酸纤维素滤膜9.定性滤纸10.1×TBST洗涤液三、材料6.考马斯蓝脱色液7.转印缓冲液8.硝酸纤维素滤膜9.定性滤纸10.1×TBST洗涤液

  15. 三、材料11.封闭液:5%脱脂牛奶12.一级抗体:兔抗APP免疫血清13.二级抗体:HRP标记羊抗兔IgG14.显色剂:3,3’-二氨基联苯胺(DAB)(A+B,使用前混合)15.终止液:蒸馏水三、材料11.封闭液:5%脱脂牛奶12.一级抗体:兔抗APP免疫血清13.二级抗体:HRP标记羊抗兔IgG14.显色剂:3,3’-二氨基联苯胺(DAB)(A+B,使用前混合)15.终止液:蒸馏水

  16. 四、操作步骤1.SDS-PAGE凝胶制备及蛋白质样品的处理:略。四、操作步骤1.SDS-PAGE凝胶制备及蛋白质样品的处理:略。

  17. 四、操作步骤2.电泳分离: 在第1至12孔中分别加入:菌体-分泌蛋白-Marker-空白-Marker-分泌蛋白-菌体-空白-空白-Marker-分泌蛋白-菌体。

  18. 四、操作步骤2.电泳分离: 将电泳装置与电源相接,80V,30min;换120V,待溴酚蓝刚移出分离胶底部时关掉电源(约90min)。

  19. 四、操作步骤3.转印: 电泳结束后,将凝胶转移至洁净塑料薄膜表面,用钢尺切取1~7孔,剔除浓缩胶,量取实际转膜用胶块大小(长×宽)。剩余凝胶用染色液浸泡。

  20. 四、操作步骤3.转印:戴上手套,切4张定性滤纸和1张NC膜。用蒸馏水润湿定性滤纸和NC膜,用铅笔在滤膜一角做标记(组号)。四、操作步骤3.转印:戴上手套,切4张定性滤纸和1张NC膜。用蒸馏水润湿定性滤纸和NC膜,用铅笔在滤膜一角做标记(组号)。 滤纸和NC膜的大小与凝胶相同或略小

  21. 四、操作步骤3.转印: 安装转印装置:夹板(黑色)-海绵垫-2层滤纸-凝胶-NC膜-2层滤纸-海绵垫-夹板(白色),固定,通电,调80V,转印1小时。 每加一层都需准确对齐,并排尽气泡。

  22. 四、操作步骤4.封闭 转印结束后,取出NC膜放入洁净平皿,加入封闭液20mL,平放于摇床上室温反应1小时。

  23. 四、操作步骤5.洗涤 用眼科镊夹住硝酸纤维素滤膜某角,放入另一洁净平皿,加入洗涤液15mL,置摇床上5min,换新的洗涤液;共洗涤3次。

  24. 四、操作步骤6.加一抗 把NC膜放入一新的平皿中,加入用TBST以1:40稀释的免疫血清15mL,平放于摇床上室温反应30min。之后洗涤滤膜3次。

  25. 四、操作步骤7.加二抗 把NC膜放入一新的平皿中,加入用TBST以1:5000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG 10ml,室温反应30min。 之后,NC膜用TBST洗涤3次,再用TBS洗涤2次。

  26. 四、操作步骤8.显色 配制显色液2mL,把NC膜放入显色液中,显色1~15 min,一旦出现条带,立即将NC膜转至蒸馏水中,终止酶促反应,即可观察。 可用成像系统或相机拍摄图片。

  27. 四、操作步骤10.结果判读:观察共出现多少条杂交带,各条带分子量大小约为多少? 与蛋白质考马斯蓝染色结果对比,看看是那些区段的蛋白出现显色反应?蛋白量与显色强度关系?

  28. 五、思考题 1.为什么滤纸必须与凝胶大小完全一致? 2.转印时为什么都必须带手套并排气泡? 3.在显色时应注意哪些问题? 4.请简述免疫印迹的原理,并将之与免疫学相关概念联系起来。