Génexpresszió más ( nem - E.coli ) prokar iótában

1. Génexpresszió más (nem-E.coli) prokariótában Bacillus subtilis elsőként (azE.coliután) http://www.danforthcenter.org/Cells/images/

2. Miért termeltessünk heterológ fehérjétBacillus subtilis-ban? • Sok fehérje kiválasztása a tápoldatba, nagy mennyiségben ! • SZEKRÉCIÓ! • 2) Nincs patogén törzs • 3) Jól ismert, nagy térfogatú ipari fermentációk Hátrányok: 1) Korlátozott számú vektor 2) Az optimalizált vektor rendszerek védettek 3) Nem glikozilez 4) Sok proteáz – terméket tönkre teszi

3. Optimalizált B. subtilis “Cell Factory”? • A B. subtilis genom 12% -ának deléciója, • nincs rá szükség a növekedéshez • A felszabaduló energia a termék-képződésre fordítódhat. x x x x x

4. 2) A Bacillus subtilis Sec-függő ésSec-független szekréciós útvonalai alaposan tanulmányozhatók és valószínűleg javíthatók is A szekréciós útvonal utolsó lépései problémásak, amelyek citoplazma membránon történő transzlokációt követik. a) A SipS (SPáz) túltermeltetése segít A későbbi proteolízis a fő probléma. A transzlokálódott fehérjék másodlagos szerkezete a sejtfal környezetben alakul aktívvá és proteáz rezisztenssé. b) ezt pl. a PrsA, a tiol-diszulfid reduktázok és kationok (pl. Ca2+ és Fe3+) katalizálják.

5. Néhány termék • Enzimek • Proteázok • Amilázok • Finom vegyszerek • Aminosavak • vitaminok • Poliszacharidok • hialuronsav

6. Az expressziós kazetta

7. Bacillus gazdák • Bacillus subtilis • Szekréció jó • amyE, nprE, aprE, spoIIAC, srfC deléciók • Természetes kompetencia • Bacillus licheniformis • Szekréció jó • Kis extracelluláris proteáz aktivitás, spo • Elektroporáció, konjugáció, protoplaszt

8. Géncsere

13. Törzsfejlesztéshabzás Surfactin: felületaktív lipopeptid

14. Pigment mentes törzs

15. Ilyen egyszerű a dolog? • Valahol mindig van valami probléma

16. Transzkripciónál és az mRNS telítés

17. A termelő törzs: erős promóter és nagy kópiaszám (a régi módi)

18. Az mRNS telítés lehetőségei

19. Erősebb promóterek: a tandem promóter/cry3A stabilizáló technika

20. A termelő törzs (új megoldás) • Inzerció több, nem kapcsolt lókuszba • 100%-os stabilitás • mRNS telítés • Marker mentes termelő törzs

21. Maximális termelés egy kópiás expressziós kazettáról

22. Hialuronsav termelés B. subtilis-szel

23. Hialuronsav termelés Streptococcus törzsekkel

25. Hialuronsav termelés B. subtilis-szel, mesterséges operon

26. Operon a kromoszómába

28. EUKARIÓTA expressziós rendszerek • Élesztő • Baculovírus • Emlős Posztszintetikus módosítások

29. Expresszó élesztőben Autonóm replikálódó vektorok -> shuttle vektorok

30. Integrációs vektorokjobb stabilitás, jobb termelés

33. Hatékony kiválasztás • Ha toxikus a fehérje • Ha S-S hidak kellenek • S. cerevisiae hiperglikozilál • P. pastoris nem

34. P. pastoris

37. Rovar sejtbenmajdnem emlős minőség • Baculovírus • Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV)

39. EMLŐS sejt