MIOPATIAS MITOCONDRIAIS Carolina Fischinger Moura de Souza

1. MIOPATIAS MITOCONDRIAIS Carolina Fischinger Moura de Souza cfsouza@hcpa.ufrgs.br

2. A MITOCÔNDRIA • Glicose • Responsável pela energia celular • Possui seu próprio DNA mtDNA • Local de várias rotas metabólicas

3. A MITOCONDRIA • Glicose • Responsável pela energia celular • Possui seu próprio DNA mtDNA • Local de várias rotas metabólicas Espaço intermembranas Matriz:diversas proteínas e ciclo de Krebs e o mtDNA Membrana interna:CRM Membrana externa crista

4. CADEIA RESPIRATÓRIA MITOCONDRIAL complexo I complexo II complexo III complexo IV complexo V Succinato fumarato Subunidades codif.pelo mtDNA 7 0 1 3 2 = 13 Subunidades codif.pelo nDNA 39 4 10 10 12 = 75

5. Ácidos graxos + glicerol glicose amino ácidos Beta -oxidação gordura ATP O2 Ciclo de Krebs carboidrato Acetil CoA Digestão e absorção 2H H2O ADP proteínas CRM MITOCÔNDRIA

6. OXOPHOS: requer uma ação orquestrada de 5 complexos enzimáticos com transferência de elétrons pelos carreadores NADH e FADH2 para a molécula de oxigênio gradiente eletroquímico que converte ADP em ATP Produção aeróbia de energia:

7. AS DOENÇAS MITOCONDRIAIS Patologias de expressão clínica heterogênea caracterizadas por uma disfunção na produção de energia CERÉBRO MÚSCULO CORAÇÃO MULTISSISTÊMICAS

8. ENCEFALOPATIA CONVULSÕES RETINITE PIGMENTAR DEMÊNCIA DEPRESSÃO ATAXIA ENXAQUECA AVC SURDEZ NEUROSSENSORIAL CARDIOMIOPATIA HIPERTRÓFICA OU DILATADA DEFEITO DE CONDUÇÃO CARDÍACO ALT. TIREÓIDE DIABETE MELITUS BAIXA ESTATURA ALTERAÇÕES NA FIBRA MUSCULAR FRAQUEZA FADIGA INTOLERÂNCIA AO EXERCÍCIO NEUROPATIA PERIFÉRICA INSUF. HEPATICA TUBULOPATIA RENAL INSUF. MEDULA ÓSSEA MIOPATIA

9. HERANÇA MITOCONDRIAL

10. A herança materna: Cada célula humana contém 100 mitocôndrias e cada uma contém 2 a 10 cópias de mtDNA

11. mtDNA 37 genes: • 2 RNAs ribossômicos • 22 RNAs transportadores • 13 RNAs mensageiros = 13 genes que codificam para as proteínas da CRM

12. DOENÇAS MITOCONDRIAIS • Devido ao número variável de mitocôndrias e de mtDNA nos diferentes tecidos  co-existência de mtDNA normal e mutado  Heteroplasmia. • Mesma mutação  diferentes manifestações clínicas. • Diferentes mutações  manifestação clínica igual. • Crianças X adultos. • Elevada freqüência: 1/5.000- 10.000 nascidos vivos (McFarland R. et al, 2002). • Causadas por mutações que envolvem o genoma mitocondrial e nuclear.

13. CLASSIFICAÇÃO Mutações do mtDNA Mutações do DNA nuclear deleções e duplicações de larga escala esporádico

14. CPEO -Oftalmoplegia Externa Crônica Progressiva KSS -Síndrome de Kearns Sayre – alterações cardíacas, proteínorraquia elevada, oftalmoplegia PS –Síndrome de Pearson – alterações na medula óssea – pancitopenia, anemia sideroblástica DOENÇA MULTISSISTÊMICA PADRÃO MIOPÁTICO

15. CPEO –17 ANOS CPEO –30 ANOS KSS–30 ANOS KSS –35 ANOS KSS –35 ANOS

16. 8 ANOS 13 ANOS 10 ANOS 13 ANOS

17. CLASSIFICAÇÃO Mutações do mtDNA mutações de ponto e microdeleção Herança materna > 200 tipos diferentes

18. MELAS-Miopatia, Encefalopatia, Acidose Lática e Episódios de Acidente Vascular Cerebral (Mutação A3243G) MERRF- Epilepsia Mioclônica com Fibras Rotas Vermelhas (RRF) (Mutação A8344G) • tRNA: mRNA: gene ATPase NARP-Neuropatia, Ataxia e Retinopatia Pigmentar (mutação T8993G) Síndrome de LEIGH (DE TRANSMISSÃO MATERNA)- Encefalomiopatia Subaguda Necrotizante DOENÇA MULTISSISTÊMICA ENCEFALOPATIA PROGRESSIVA

19. MELAS – PACIENTE 18 ANOS MELAS – PACIENTE 7 ANOS LEIGH – PACIENTE 1 ANO RRF

20. CLASSIFICAÇÃO Mutações do mtDNA Mutações do DNA nuclear defeitos bioquímicos na CRM Herança mendeliana

21. CLASSIFICAÇÃO Defeitos de sinalização intergenômica Mutações do mtDNA Mutações do DNA nuclear deleções e duplicações de larga escala

22. DIAGNÓSTICO DAS MIOPATIAS MITOCONDRIAIS Manifestações Clínicas Músculo: CPEO, fraqueza, fadiga SNC: ataxia, surdez, atrofia óptica HF sugestiva Investigação Clínica Sindrome mitocondrial? (MELAS, MERRF,NARP,LHON) SIM Testar mutações comuns no sangue NÃO Negativo HISTOQUÍMICA MOLECULAR BIOQUÍMICA

23. ASPECTOS HISTOQUÍMICOS Corte transversal de tecido muscular: Paciente com S. de Kearns Sayre apresentando hiperatividade (RRF) em SDH e ausência de atividade em Citocromo C Oxidase RRF na coloração de Tricromio de Gomori. RRF representada na reação SDH. Hipoatividade da citocromo C oxidase

24. ASPECTOS BIOQUÍMICOS • Medida da atividade das enzimas da CRM por fluorimetria • Idealmente com homogeneizado de tecido muscular fresco - Medida dos Complexos I, II, III, IV, V • Trabalhoso • Custo elevado • Difícil padronização • Difícil interpretação • Defeitos isolados ou mistos

25. ASPECTOS MOLECULARES • Mutações de ponto: • A3243G, 3271-T, A8344G, T8356C e T8993G  PCR e digestão por endonuclease de restrição. • Deleção: • Extração de DNA (músculo)  digestão com a PvuII  separação dos fragmentos por eletroforese em gel de agarose 0,8%  transferência para membrana de nylon Hybond+  hibridização com sonda previamente marcada com o kit ECLTM Direct nucleic acid labelling and detection system  auto-radiografia da membrana. • Seqüenciamento: • método da terminação por fluorescência em seqüenciador automático (ABI PrisMTM 310 - Applied Biosystems).

26. 1 2 3 4 5 6 7 Canaleta 1: controle positivo; canaletas 3 e 7: pacientes com uma deleção no DNA mitocondrial; canaletas 2, 4, 5 e 6: pacientes que não apresentam uma deleção no DNA mitocondrial. Auto-radiografia da detecção de deleções no mtDNA 16.569 kb 11.592 kb

27. PROGNÓSTICO Arpa, J. et al. Prevalence and Progression of Mitochondrial Diseases: a study of 50 patients Muscle Nerv 28: 690-695, 2003

28. TRATAMENTO • Acompanhamento multidisciplinar: neuro, oftalmo, endócrino, cardio, nefro, gastro, fisioterapeuta, outros. • Exercício físico regular individualizado e respeitando limites • Evitar stress físico e mental, frio, calor, uso de alcool, nicotina, medicações como corticóides, ác. Valpróico, barbitúricos, tetraciclina, cloranfenicol, etc. • Dieta: regular, evitar jejum prolongado, redução de gorduras e rica em CH.

29. TRATAMENTO • Vitaminas e outras medicações: sem comprovação científica, tto empírico, mínimo benefício: • Aceptores de elétrons como a menadiona (vitamina K3) e filoquinona (vitamina K1), e ácido ascórbico (vitamina C) tem sido usados no sentido de melhorar o transporte de elétrons na cadeia respiratória, • Riboflavina (vitamina B2), na dose de 50-100 mg/dia age como cofator dos complexos I e II. • Coenzima Q10 (5-15 mg/kg/dia) • Creatina 100-200 mg/kg/dia • Dicloroacetato – redução dos níveis de lactato

30. UM ESTUDO CLÍNICO, BIOQUÍMICO, HISTOQUÍMICO E GENÉTICO-MOLECULAR DE PACIENTES COM DOENÇAS DO DNA MITOCONDRIAL

31. VARIÁVEL PROBABILIDADE • Alta • Combinação de sintomas multisistêmicos patognomônicos de doença mitocondrial, incluindo, no mínimo, 3 sistemas (neurologico, muscular, cardíaco, endócrino, gastrointestinal, renal, hematológico, otológico, oftalmológico ou hepático); • Apresentação de síndrome clássica como MELAS, MERRF, Kearns Sayre, Leigh com herança materna; • Baixa • Crianças com encefalopatia não específica apresentando crises convulsivas, acidose lática e/ou hipotonia; • Pacientes com evolução atípica de doença envolvendo SNC sem achados clínicos característicos e em que já foram excluídas outras patologias; • Sintomas isolados: AVC em pacientes jovens, cardiomiopatia, manifestações endocrinológica ou neurológicas;

32. RESULTADOS – análise de mutações Mutação no mtDNA: 17 (39,5%)

33. RESULTADOS – comparação dos positivos com negativos * Média do Rank

34. RESULTADOS – comparação dos positivos com negativos * Média do Rank