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Tema 12: Genómica

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Tema 12: Genómica. Griffiths AJ et al., (2000) Klug WS y Cummings MR (2006) Links to Animal Genomic Research web site and Database Resources http://www.genome.iastate.edu/resources/other.html. Inma Martín-Burriel: minma@unizar.es. Contenidos. Introducción Genómica estructural

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Presentation Transcript
tema 12 gen mica

Tema 12: Genómica

Griffiths AJ et al., (2000)

Klug WS y Cummings MR (2006)

Links to Animal Genomic Research web site and Database Resources

http://www.genome.iastate.edu/resources/other.html

Inma Martín-Burriel: minma@unizar.es

contenidos
Contenidos
  • Introducción
  • Genómica estructural
    • Polimorfismos del DNA: tipos, metodología de estudio
    • Aplicaciones de los polimorfismos
  • Genómica funcional
definiciones
Definiciones
  • Genómica es el conjunto de ciencias y técnicas dedicadas al estudio integral del funcionamiento, el contenido, la evolución y el origen de los genomas. Es una de las áreas más vanguardistas de la Biología. La genómica usa conocimientos derivados de distintas ciencias como son: biología molecular, bioquímica, informática, estadística, matemáticas, física, etc.
  • Genomics is a discipline in genetics concerning the study of the genomes of organisms. The field includes intensive efforts to determine the entire DNA sequence of organisms and fine-scale genetic mapping efforts. The field also includes studies of intragenomic phenomena such as heterosis, epistasis, pleiotropy and other interactions between loci and alleles within the genome.
historia de la gen mica
Historia de la Genómica
  • 1977: Secuenciación completa del genoma de 5.400 nt del virus ØX174 (Sanger et al.)
  • Desarrollo de métodos de secuenciación: secuencia de genomas eucarióticos.
slide5

1976-1977, Allan Maxam y Walter Gilbert

Métodos de terminación de la cadena o método de Sanger

Pirosecuenciación

Secuenciación a gran escala (NGS)

slide6

GENÓMICA

Estructural

Funcional

Secuencia descubrimiento genes, localización

Función de los genes

Regulación

Comparativa

Compara genomas de diversas especies para elucidar las relaciones funcionales y evolutivas.

Desarrollo de organismos modelo de enfermedades

gen mica
ESTRUCTURAL:

Caracterización de la naturaleza física de genomas completos

FUNCIONAL:

Caracterización del proteoma y de los patrones globales de expresión génica

Genómica

Caracterización molecular de genomas completos

clasificaci n del dna eucariota

DNA eucariótico

Genes funcionales

de copia única

DNA de secuencia

repetida

DNA separador

Secuencias funcionales

Secuencias sin función

conocida

Secuencias funcionales

No codificantes

Repeticiones heterocromatina

Del centrómero

Familias de genes codificantes

(y pseudogenes asociados)

VNTR

Familias de genes dispersos

Secuencias derivadas

De transposiciones

Familias de genes en tándem

Transposones

Retrotransposones

Genómica estructural

Clasificación del DNA eucariota

Caracterización de la naturaleza física de genomas:

- Polimorfismos del DNA

- Cartografía

polimorfismo gen tico
Polimorfismo genético

Polimorfismo: Variante genética que aparece en la población con una frecuencia > 1%

  • Polimorfismo bioquímico:
    • Detección de variación al nivel del producto del gen: proteínas, enzimas
  • Polimorfismos del DNA:
    • Variaciones presentes en la secuencia de bases
      • Polimorfismos producidos por mutaciones puntuales
      • Polimorfismos del número de repeticiones en tándem

http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/P/Polymorphisms.html

http://www.chinaphar.com/1671-4083/25/986.htm

http://www.systemsbiology.org/technology/data_generation/Microsatellite

slide11

Alelo 1

CA

CA

CA

CA

CA

CA

CA

CA

CA

CA

CA

CA

CA

CA

CA

CA

Alelo 2

Polimorfismos debidos a variaciones en el número de repeticiones de DNA en tándem

  • DNA microsatélite (STR):
    • Short Tandem Repeat
    • Pequeñas formaciones (generalmente < 150pb) de repeticiones en tándem de secuencias muy simples (de 1 a 4 nucleótidos)
    • Repartidas por todo el genoma, normalmente en intrones. Frecuentes y altamente polimóficos (número medio de alelos 10)
    • Herencia mendeliana codominante
slide12

Genotipado:

Secuenciación:

ACGT

  • Visualización de los microsatélites
slide13

Implicaciones de las secuencias microsatélites en patologías:

    • Expansión de microsatélites de trinucleótidos:
      • Síndrome de X frágil (FMR-1) (CCG)n
      • Distrofia miotónica (DM) (CTG)n
      • Enfermedad de Huntington (HD) (CAG)n
      • Ataxia de Friedreich (FA)
      • Nueve formas de ataxia espinocerebelar (SCA)
    • Expansión de tetranucleótidos: DM2
    • Expansión de pentanucleótidos: SCA10

Enfermedades humanas se han creado animales modelo

slide14

Secuencias de DNA dispersas

  • ¿DNA basura? ¿DNA egoista?
  • - ¿Regulación de la expresión?
  • ¿Puntos de recombinación?
  • Control de la segregación de cromosomas (centrómeros)
  • Estabilización de los cromosomas en la replicación (telómeros)
slide16

ENCODE: Encyclopedia of DNA Elements:

  • Proteinor non-coding RNA
  • Proteinbinding
  • Specificchromosomestructure
slide17

TACGAGCTA

TACGGGCTA

Alelo 1

Alelo 2

Polimorfismos debidos a mutaciones puntuales

  • Variación de un nucleótido en una posición determinada.
  • Frecuencia:1/1000pb
  • También conocidos como SNP (Single Nucleotide Polymorphisms)
  • Cambios de bases:
    • Transiciones:
      • Purina Purina:
      • Pirimidina Pirimidina:
    • Transversiones
      • PurinaPirimidina:
      • Pirimidina Purina

A G Purinas

T C Pirimidinas

slide18
SNP: Single Nucleotide Polymorphisms:
    • Polimorfismo muy frecuente (1/300 pb)
    • 10 a 30 millones de SNP en el genoma humano
    • Dos posibles alternativas en cada individuo
    • Herencia es muy estable (baja tasa de mutación 10-6 vs 10-3 de los microsatélites)
    • Fácil estandarización
    • Aplicaciones en la determinación de enfermedades y en farmacogenética
slide19
Detección de los SNP:

RFLP:

Southern Blot

PCR + RFLP

Secuenciación

Minisecuenciación

Sondas específicas

SSCPs

PCR en tiempo real…

RFLPs

Detección mediante enzimas de restricción:

Southern Blot

PCR+RFLP

Normalmente determinados en exones

RFLPs-SNP

  • Origen: mutaciones puntuales
  • Variabilidad: 2 alelos
  • Localización: exones, intrones, regiones reguladoras, DNA espaciador
slide20

RFLP:

Aat II

TGGACGTCT

TGGATGTCT

Alelo 1

Alelo 2

Detección de mutaciones puntuales

Sonda

Alelo 1 Alelo 2

MCL1

marcador del dna gen tico
Marcador del DNA (genético)
  • Gen o secuencia de DNA cuya localización en el genoma se conoce.
  • Características:
    • Tienen que ser polimórficos (en la población).
    • Si es un gen no interesa la función sino las variaciones en el DNA (que pueden reflejarse en diferencias funcionales) (ej. Grupo sanguíneo). HAY POCOS GENES MARCADORES.
    • Las variaciones en un segmento de DNA se transmiten según las reglas Mendelianas de codominancia. HAY MUCHAS SECUENCIAS MARCADORES.
tipos de marcadores
Tipos de marcadores
  • SNP (or Single nucleotide polymorphism)
  • RFLP (or Restriction fragment length polymorphism)
  • RAD markers (or Restriction site associated DNA markers)
  • AFLP (or Amplified fragment length polymorphism)
  • VNTR (or Variable number tandem repeat)
  • Microsatellite polymorphism, SSR (or Simple sequence repeat)
  • STR (or Short tandem repeat)
  • SSLP (or Simple sequence length polymorphism)
  • RAPD (or Random amplification of polymorphic DNA)
  • SFP (or Single feature polymorphism)
  • DArT (or Diversity Arrays Technology)
slide24
Aplicaciones de los polimorfismos del DNA:
    • Diagnóstico genético
    • Identificación individual
    • Construcción de los mapas génicos
    • Ligamiento con fenotipos
slide25

Diagnóstico genético indirecto:

Análisis de marcadores genéticos

X

Gen alterado

Mutación puntual

Microsatélite

RFLP

Deleción

Inserción

Marcador polimórfico

Genotipo del marcador  Genotipo del gen dañado

slide28

Identificación individual:

    • Marcadores fenotípicos (HLA, Gr. Sanguíneos)
    • Análisis de marcadores microsatélites
      • PCR, secuenciación
    • Fingerprinting (minisat.)

Microsatélites

Minisatélites

Control de filiación

Control de libros genalógicos

Detección mediante RFLP + Southern

slide29
Mapas del genoma:
    • Mapa genético
      • Posiciones relativas de los genes entre si, sin anclaje físico
      • Distancia entre marcadores determinada por la frecuencia de recombinación en la meiosis
    • Mapa físico
      • Posición exacta de un gen
      • Distancia entre marcadores determinada por nº de pb
secuenciaci n de genomas
Secuenciación de genomas

Construcción de librerías

PCR en puente

Secuenciación por síntesis

an lisis bioinform tico ngs
Análisis bioinformático (NGS)
  • Preprocesado de las secuencias
  • Control de calidad
  • Alineamiento de secuencias: formación de contigs
  • Alineamiento con las referencias
  • Búsqueda de variantes
slide32
Ligamiento:

Identificación de regiones del genoma con un nº de alelos compartidos en individuos afectados > al esperado (en familias)

Análisis de 500 pols

Regiones candidatas y acotamiento de la región

Alelos raros de alto riesgo

Asociación:

Análisis de individuos afectados no emparentados e identificación de alelos compartidos

Facilidad para la obtención de muestras

Necesidad de analizar miles de marcadores

Alelos de acción modesta en enfermedades comunes

Ligamiento con fenotipos

secuenciaci n del exoma
Secuenciación del Exoma
  • Alineamiento con secuencias de referencia
  • Eliminación de variantes comunes (dbSNP, HapMap8)
    • Secuenciando 3 o 4 individuos mutación causante
    • Riesgo de falsos negativos
  • Estudio de ligamiento + NGS (secuenciando familia e identificando los fragmentos cromosómicos heredados de los padres)
  • Confirmación con pruebas bioquímicas y funcionales
gen mica funcional
Genómica funcional
  • Los datos de la secuenciación a gran escala son el punto de partida de la genómica funcional
  • Búsqueda de ORF en secuencias de DNA desconocidas
  • Identificación de su función
  • Empleo de chips (microarrays) de DNA para estudio de regulación génica
chips de dna
Chips de DNA
  • Muestras de DNA ordenadas, unidas a un chip de cristal del tamaño de un cubreobjetos
  • En un chip puede haber miles de muestras (cDNA de genes conocidos)
  • Los chips se exponen a muestras de mRNA marcados procedentes de distintos tejidos (distinta fase de desarrollo, tumoral vs normal, etc.)
  • Se miden variaciones en la expresión de los tejidos
slide36

RNAseq

Algorithm overview, for paired-end RNA-Seq.

Lee S et al. Nucl. Acids Res. 2010;nar.gkq1015

© The Author(s) 2010. Published by Oxford University Press.

slide37

Aplicaciones de la Genómica

  • Conocimiento y comprensión de procesos patológicos
  • Precisión de diagnóstico:
    • Clasificación más fina (cáncer de colon, piel)
    • “Farmacogenómica”  respuesta individual a tratamientos, elección de quimioterapia
  • Evaluación correcta del riesgo genético:
    • Predicción de la agresividad tumoral
  • Prevención conocido el riesgo genético
    • Comenzar planes de vigilancia en riesgo de cáncer, hipercolesterolemia, hemocromatosis,..
slide38

Implicaciones del conocimiento del genoma

  • Análisis de recién nacidos
  • Detección de portadores
  • Desarrollo de terapias:
    • Terapia génica: reemplazar un gen alterado por el gen funcional
    • Terapia basada en la genética:
      • Diseño de nuevas drogas
      • Tratamientos basados en las bases moleculares
      • Elección del tratamiento
  • Identificación de genes con interés en producción.
videos de gen mica

Microarray:

Videos de genómica

http://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhM

http://www.youtube.com/watch?v=ePFE7yg7LvM&feature=related

http://www.youtube.com/watch?v=AhnTT6-Jgcg&feature=related

Exon Sequencing

http://www.youtube.com/watch?v=ZY_vPbpPnrc&sns=em