ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA Dr. Kremmer Tibor

1. ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA Dr. Kremmer Tibor IV. FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS MÓDSZEREK NORMÁL ÉS FORDÍTOTT FÁZISÚ KROMATOGRÁFIA EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest – 2013

2. NORMÁL ÁLLÓ FÁZISOK Szervetlen: SiO2 - Al2O3 – MgO – ZnO – Florisil - TiO2 - ZrO2stb. Szerves: Agaróz, polidextrán (Sephadex), poliakril amid polisztirol-divinil benzol, polimetil metakrilát alapú gélek, cellulóz, poliamid, csontszén, KÖTÖTT ÁLLÓ FÁZISOK (bonded phases) / \ NORMÁL (poláris) FÁZISOK FORDÍTOTT (apoláris) FÁZISOK – OH (diol) (RP, reversed phases) – CN (ciano) – alifás alkil lánccal (C2, C4, C8, C18) – NH2 (amino propil) – fenil – N(CH3)1-3 – i-propil (mono-, di-, trimetil amino) – i-butil – SO3H (szulfo propil) – ciklohexil – NO2 (nitro) HILIC– hidrofil kölcsönhatású HIC - hidrofób kölcsönhatású töltetek (anion- és kation cserélők) kromatográfiás töltetek

3. KROMATOGRÁFIA

4. ADSZORPCIÓS FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA ÁLLÓ FÁZISA SiO2 - Al2O3 – MgO – ZnO – TiO2 – ZrO2 CaO – CaSO4 (gipsz) – CaCO3– Ca3(PO4)2 (hidroxi apatit) Mg-Al-szilikátok (Florisil) Csontszén (C – PGC), cellulóz, poliamid LC – HPLC ~ TLC

5. ADSZORPCIÓS FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA ÁRAMLÓ FÁZISA APOLÁRIS, vagy KÖZEPESEN APOLÁRIS OLDÓSZER(ELEGYEK) Kirkland szerint a legtöbb adszorpciós elválasztási feladat az alábbi nyolc oldószerrel, vagy optimális kombinációjukkal megoldható: hexán – CH2Cl2 – CHCl3 – (metil-t-butil)éter – CH3OH – CH3CN – THF – H2O Más szerzők a növekvő elúciós erő (polaritás) sorrendjében hasonló oldószer (eluotróp) sorozatot ajánlanak: petroléter(hexán)–ciklohexán–széntetraklorid–toluol–diklórmetán–éter–kloroform–aceton–etilacetát–propanol–etanol–víz–ecetsav.

6. Az adszorpciós kromatográfia elválasztási folyamatainak tényezői (oxid típusú mezopórusos állófázisoknál) - Dipól-dipól, hidrogén-híd és -komplexek képződésén alapuló permanens, orientációs és indukált intermolekuláris kölcsönhatások. - A reverzibilis kötési tulajdonságokat elsősorban az adszorbens felületén igénybe vehető ún. aktív helyek száma és minősége határozza meg. - Az elválasztás mechanizmusa azon az elméleti megközelítésen alapul, hogy a különböző kölcsönhatások energiaváltozásainak eredményeként az adszorbens aktív helyein versengés van az elválasztandó anyagok és az oldószer molekulák között. - Az adszorbensek aktivitása egyrészt fajlagos felületükkel (m2g-1), másrészt - az elválasztandó vegyület típusokra specifikusabb és sokkal informatívabb adszorpciós erejével (kromatográfiás aktivitásával) jellemezhető. - Vegyület csoportok szerint az adszorpció erőssége a következő sorrendben növekszik: - alkánok, telített szénhidrogének, - olefinek, - aromás szénhidrogének, - szerves halogén vegyületek, éterek, észterek, szulfidok, nitro-származékok, - aldehidek, - ketonok, alkoholok, - aminok, amidok, szulfonok, szulfoxidok, - karbonsavak.

7. A SZILIKAGÉL SZERKEZETE H H O H H O H O H H O H

8. RÉTEGKROMATOGRÁFIA Elválasztott frakciók Oldószer áramlás Iránya (front) ☼ ☼ ☼ Minta felvitel helye (start) Réteglap Oldószer (áramló fázis)

9. EGÉSZSÉGES ÉS DAGANATOS PAJZSMIRIGY MINTÁK LIPID TARTALMÁNAK RÉTEGKROMATOGRÁFIÁS VIZSGÁLATA TUMOR NOR CHOL TG SERUM

10. POLÁRIS ÉS APOLÁRIS LIPIDEK (ZSÍROK) TLC ANALIZISE EGYDIMENZIÓS KÉT LÉPÉSES ELVÁLASZTÁS 1. - LÉPÉSBEN: CHCl3-MeOH-AcOH (35-25-4) 2. - LÉPÉSBEN: HEXÁN-ÉTER-AcOH (85-15-3) ELŐHIVÁS: PMS

11. POLÁRIS ÉS APOLÁRIS LIPIDEK EGYDIMENZIÓS-KÉTLÉPÉSES RÉTEGKROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSA ELŐHÍVÁS: SZENESÍTÉS

12. POLÁRIS (FOSZFOR)LIPIDEK KÉTDIMENZIÓS RÉTEGKROMATOGRÁFIÁJA Előhivás: PMS C C:M:NH4OH C:M:AcOH

13. FOLYADÉK-FOLYADÉK MEGOSZLÁSI KROMATOGRÁFIA PAPÍRKROMATOGRÁFIA Consden, Gordon és Martin (1944) Cellulózrostok (por) - vizes oldószer rendszerek FOLYADÉK-FOLYADÉK MEGOSZLÁSI KROMATOGRÁFIA Howard és Martin (1950) Normál fázis (SiO2) – squalen/paraffin olaj Áramló fázis: poláris oldószerelegyek HIDROFIL KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography – HILIC) Kötött normál poláris állófázisok (ioncserélők, diol, ciano, amino, stb.) Vízzel (pufferrel) elegyedő apoláris oldószer (acetonitril, dioxán, THF), amely a töltet felszínén egy állandó, vízben gazdag réteget tart fenn és különböző poláris kölcsönhatások kialakulása révén az elválasztandó anyagok szelektív megoszlását eredményezi. (Alpert, 1990) SiO2

14. FORDÍTOTT FÁZISÚ (REVERSED PHASE, RP-LC) FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA Prof. J.F.K. Huber Prof. Horváth Cs. Prof. Halász I.

15. Schematic illustration of the surface of the alkyl-silica bonded phases most widely used in reversed-phase chromatography. The octadecyl-silane junctions are bound via siloxane bridges to the surface of silica gel still containing some polar silanol residues. (Horváth és mtsai, 1966)

16. FORDÍTOTT FÁZISÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA • A fordított fázis (Reversed Phase, RP) elnevezés arra utal, hogy ebben a rendszerben az álló és áramló fázisok polaritása a normál fázisú rendszerekkel ellentétben „fordított” elrendezésű. • Ennek megfelelően a fordított fázisú folyadék kromatográfiában áramló fáziskéntpolárisabb oldószereket, leggyakrabban a víz és metanol, etanol, acetonitril, aceton, dioxán, n- és i-propanol, tetrahidrofurán, stb. elegyeit alkalmazzák. • A normál és fordított fázisú folyadék kromatográfiás módszereket összehasonlítva - a normál fázisú rendszerekben az elválasztást elsősorban az állófázis és a minta kölcsönhatása határozza meg, míg - a fordított fázisok alkalmazásakor az elválasztást inkább a mozgó fázis tulajdonságai (polaritás, oldószer elegyek, adalékok) modulálják, A töltet-minta kölcsönhatása ebből a szempontból másodlagos tényezőnek tekinthető.

17. A „FORDÍTOTT” FÁZISÚ FOLYADÉK KROMATOGRÁFIA Az „ELV” Horváth Csaba Professzor úr tolmácsolásában Horváth Cs.:Reversed-phase chromatography. Trends in Anal Chem 1 (1981) 6-12.

18. RP-HPLC ÁLLÓ FÁZISOK FEJLESZTÉSE MŰSZER FEJLESZTÉS Jellemzői - előnyei Egyszerű - hatékony - szelektív Gradiens elúció alkalmazható Vegyületcsoportok széles skáláján használható Sokoldalúan használható (RP, adalékokkal SAX, SCX) Detektálás (UV-VIS, FLU, RI, IR, LSD, VEZ, MS) tág lehetőségei Kereskedelmi termékek széles választéka Hátrányai Alacsony retenció az erősen poláris (ionos) vegyületekre Szolvát burok változása (dewetting, collapsing) Töltetek (SiO2) instabilitása, tulajdonságai (pH, Si-OH), reprodukálhatósága

19. Daganatsejtek plazma membrán szfingomielin frakcióinak elválasztása HP-RP18 oszlop (25x0,46 cm, 5 m) Izokratikus elúció, metanol-5 mM foszfát puffer, pH 7,4 (95:5 v/v) oldószer elegy. T: 250C, áramlási sebesség: 1,5 ml/perc, detektálás: 205 nm. (Kremmer, 1988)

20. A B C Természetes oligo(poli)aminok danzil származékainak RP-HPLC elválasztása Nucleosil C18 oszlopon (20x0,46 cm, 5 m), 10 mM ammónium foszfát (pH 4,4)-acetonitril (1:1) és acetonitril-metanol (37:3) gradiens elúcióval. A – Referencia vegyületek, B – humán vizelet minta és C – humán szérum poliamin spektruma. (Kremmer és mtsai, 1984)

21. Humán szérum savanyú alfa-1 glikoprotein (AGP) tripszines emésztési termékeinek elválasztása Vydac 218WP54 (300P wide pore C18, 25x0,46 cm, 5 m) oszlopon lineáris gradiens elúcióval, 0,1% trifloroecetsavat tartalmazó A – víz-acetonitril (95:5) és B - víz-acetonitril (5:95) (v/v) oldószereleggyel.

22. . Nukleotid foszfátok (A - CMP, UMP, GMP, IMP, CDP, UDP, AMP, GDP, CTP, UTP, GTP, ADP, ATP) és a kritikus párok (B – CMP-UMP, IMP-GMP, OMP-AMP) elválasztása fordított fázisú ion-pár folyadékkromatográfiával. Nucleosil ODS oszlop (25x0,46 cm, 5 m) lineáris gradiens elúció. Áramló fázis: 0,08 mM NaCl 0,025 M tetrabutil ammonium foszfát puffer (pH 6,0), Áramlási sebesség: 0,75 ml/perc, detektálás: 254 nm (Kremmer és mtsai, 1987).

23. . Adenozin trifoszfát (ATP) retenciós tényezőjének változása az ion-pár RP-HPLC paramétereinek (NaCl, metanol) függvényében

24. KÖSZÖNÖM A FIGYELMET