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UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI ROMA “TOR VERGATA”

Relatore Prof. Luciana Avigliano. Candidata Laura Masciullo. UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI ROMA “TOR VERGATA”. EFFETTI APOPTOTICI DI ORIGANUM VULGARE IN CELLULE TUMORALI DEL COLON. CANCRO DEL COLON. FATTORI GENETICI. FATTORI AMBIENTALI. DIETA MEDITERRANEA: BASSO RISCHIO

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Presentation Transcript

  1. Relatore Prof. Luciana Avigliano Candidata Laura Masciullo UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI ROMA “TOR VERGATA” EFFETTI APOPTOTICI DI ORIGANUM VULGARE IN CELLULE TUMORALI DEL COLON

  2. CANCRO DEL COLON FATTORI GENETICI FATTORI AMBIENTALI DIETA MEDITERRANEA: BASSO RISCHIO Elevato consumo ortaggi, frutta, spezie, legumi, cereali DIETA OCCIDENTALE: ALTO RISCHIO basso consumo di prodotti di origine vegetale

  3. L’origano è ampiamente utilizzato in tutti i paesi del bacino mediterraneo

  4. SCOPO DELLO STUDIO Effetti chemiopreventivi dell’Origanum vulgare: • proliferazione cellulare • stato redox • apoptosi MODELLO SPERIMENTALE: CELLULE UMANE Cancerose: cellule di adenocarcinoma del colon (Caco2) Normali: colture primarie di fibroblasti e colonociti (FHC)

  5. PREPARAZIONE DELL’ESTRATTO DI ORIGANO • FOGLIE E FIORI ESSICCATI FRANTUMATI FINEMENTE • ESTRAZIONE CON ETANOLO 70% PER 24 ORE A 4°C, AL BUIO • FILTRAZIONE SU CARTA WHATMAN NO. 1 • CENTRIFUGAZIONE A 2500 RPM PER 20 MIN • CONCENTRAZIONE DEL SUPERNATANTE SOTTO FLUSSO D’AZOTO • ESTRATTO DI ORIGANO LIOFILIZZATO Resa: 20 % (2.5 gr di origano essiccato = 0.5 gr estratto secco)

  6. Composti fenolici flavonoidi stilbeni acidi fenolici lignani monoterpeni flavoni flavanoni flavanoli antocianine flavonoli isoflavoni Caratterizzazione dell’estratto origano Contenuto Totale Fenolico (Metodo Colorimetrico Folin-Ciocalteu): 150 mg di acido gallico equivalenti/gr di estratto secco Capacità Antiossidante Totale: 2.4 ± 0.2 mmol di Trolox equivalenti/g di estratto secco

  7. Acido rosmarinico Acido ferulico Daidzeina Acido caffeico Esperetina minuti ANALISI COMPOSTI FENOLICI (HPLC con rivelatore a fotodiodi  = 310 nm)

  8. Composti fenolici identificati mediante analisi cromatografica (HPLC-DAD)

  9. 300 mg/ml 120 100 * 80 # # 60 % del controllo 40 20 0 12 24 48 72 ore 120 500 mg/ml * 100 * 80 % del controllo # # 60 # 40 # 20 0 12 24 48 72 ore L’origano esercita differenti effetti sulle cellule normali e cancerose FHC FIBROBLASTI CaCo2 * p<0,05 # p<0,001

  10. L’origano promuove l’arresto della crescita nella fase G2 prevenendo l’entrata in mitosi e inducendo morte cellulare Analisi al citofluorimetro 350 350 Ctrl Ipodiploide 10% G0/G1 49% G2/M 14% S 37% origano Ipodiploide 24% G0/G1 31% G2/M 30% S 39% 280 280 210 210 Eventi Eventi 140 140 70 70 0 0 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 FL2-H FL2-H

  11. 12 % Ctrl origano 18 % Necrosi Necrosi 13 % 30 % Normale Normale Apoptosi Apoptosi L’origano induce sia la necrosi sia l’apoptosi Colorazione con ioduro di propidio ed analisi al FACS

  12. Ctrl origano PARP (89 kDa) caspasi 3 (17 kDa) Ctrl 3 origano * * 2 Volte su controllo 1 0 * p<0,001 Casp-3 PARP L’origano attiva le caspasi esecutrici

  13. # L’origano attiva la via intrinseca e la via estrinseca dell’apoptosi Via recettoriale caspasi 8 (18 kDa) APAF-1 (130 kDa) pro-caspasi 9 (47 kDa) Via mitocondriale pro-apoptotico Bak (25 kDa) anti-apoptotico Bcl-xL (30 kDa) tubulina * p<0,05 # p<0,001 5 Ctrl 3 # # origano 4 2.5 2 3 Volte su controllo 1.5 * 2 * 1 1 0.5 0 0 Casp-8 APAF-1 Pro casp-9 Bak Bcl-xL

  14. Ctrl origano Fluorescenza (unità arbitrarie) Ctrl origano L’origano promuove una perturbazione nel potenziale di membrana mitocondriale Colorazione con JC-1 ed analisi al FACS

  15. L’origano riduce il glutatione totale ed incrementa il GSSG Capacità antiossidante totale Livelli di ROS Origano 36% Ctrl 32% nmoli Trolox eq./mg proteina Ctrl origano Glutatione totale Glutatione ossidato Glutatione totale (nmoli/mg proteina) GSSG/GSH x 100 Ctrl origano Ctrl origano

  16. L’estratto di origano promuove: Alterazione dello stato redox Attivazione delle vie apoptotiche Arresto della crescita e morte cellulare

  17. 100 mg CONCLUSIONI Tali effetti non sono ascrivibili ad un singolo componente, ma all’alimento “in toto” I colonociti sono le cellule che “in vivo” entrano a diretto contatto con la spezia Gli effetti anti-tumorali si ottengono con quantità di origano raggiungibili con la dieta Mediterranea La diffusione dell’origano potrebbe essere correlata a questi effetti benefici

  18. 1,20 1,00 0,80 volte su controllo 0,60 0,40 0,20 0,00 CTRL A.GALLICO DAIDZEINA A. CAFFEICO ESPERETINA DIOSMETINA A. FERULICO NARINGENINA CARVACROLO A. COUMARICO (+) CATECHINA A. ROSMARINICO A. CLOROGENICO A. PROTOCATECUICO 1,20 1,00 0,80 volte su controllo 0,60 0,40 0,20 0,00 CTRL ORI 500 MIX 13 Gli effetti protettivi dipendono dall’estratto “in toto” e non dai singoli componenti * * * p<0,001

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