HYGIENE ET CONTRÔLE SANITAIRE DE L’ANIMALERIE

1. HYGIENE ET CONTRÔLE SANITAIRE DE L’ANIMALERIE Nathalie Kapel Laboratoire de Parasitologie DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

2. Pas de pathologie pouvant interférer avec la réponse expérimentale ANIMAUX D’EXPERIMENTATION = organismes standardisés EXPERIMENTATIONS REPRODUCTIBLES • MAINTIEN de la standardisation indispensable • dans les unités d’élevage • dans les animaleries Mise en place d’une BARRIERE SANITAIRE répondant aux "lignes directrices relatives à l'hébergement et aux soins des animaux" pour prévenir tout développement infectieux ( pathologie infectieuse) DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

3. L’animalerie sera : • Séparée des autres laboratoires • Munie de sas d’entrée et de sortie • Organisée avec un vestiaire séparé • Avec couloirs séparés entrée/sortie • Avec un système de ventilation autonome et contrôlé • Avec des matériaux de surface étanche facilement lavable et désinfectable • Avec des zones séparées de stockages des litières propres/nourriture et des déchets • Dotées en congélateur(s), autoclave(s),bains germicide(s).. DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

4. Paramètres qui influent sur l’environnement de l’animal et sources de contamination DIRECTES/INDIRECTES Transfert d’animaux Aliments/eau/litière MACRO- Température Cage Microenvironnement Facteurs génétiques Hygrométrie NH3 + CO2 Lumière ENVIRONNEMENT Ventilation Bruits Personnel : pathogènes animal  homme DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

5. La prise en charge des animaux devra prendre en compte : • Objectifs expérimentaux • Mode d’hébergement • Type d’expérience (aigue ou chronique) • Présence d’éléments potentiellement contaminants (animaux ou matériels) • L’existence d’agents interférents … Contrôle et Elimination de toutes les variables autres que celle(s) étudiée(s) Aspect : génétique, physique, chimique, microbiologique DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

6. HYGIENE et CONTROLE SANITAIRE en expérimentation animale • Mesures permettant le maintien des locaux et donc des animaux dans un état sanitaire satisfaisant= Eviter la contamination des animaux • Mesures vis-à-vis du personnel= éviter la contamination des personnels animaliers et chercheurs (zoonoses, produits d’excrétion/sécrétion, infection expérimentales…. ) = limiter le risque physique (bruit..) et chimique (solutions de nettoyage, désinfectants..) • = réduire le risque allergique (10 à 40% des personnels) • Mesures permettant d’assurer l’intégrité de l’environnement = ISO 14000 DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

7. 2 étape complémentaires : • Contrôle  traitement des entrées et sorties • Bio-nettoyage et désinfection des locaux et des équipements PROPHYLAXIE SANITAIRE • Rappel : agrément de l’animalerie • Contrôle du plan de nettoyage • Contrôle des conditions d’ambiance…… DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

8. SOURCES DE CONTAMINATION Transmissions directes • Rongeurs sauvages ( quarantaine) • Transferts d’animaux ++++ ( isolateurs) Animaux souvent contaminant avant le développement d’une symptomatologie clinique ou biologique Transmissions directes • Personnel : manuportée (changement de gants à chaque cage ou portoir), vêtements • Litière +++ • Matériel ++ • Alimentation, fluides • Insectes • Introduction de produits biologiques (sérum, lignée cellulaire….) DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

9. 1. CONTRÔLE DES ENTREES ET SORTIES • Animaux • Élevages contrôlés (certificat) : • (certificat de contrôle de l’état sanitaire indispensable pour pouvoir • faire voyager les animaux) • = envoi dans des conditions sanitaires contrôlées • (boites avec filtres…..) • Animaux de «récupération» : Quarantaine Animaux transgéniques venant d’unités de recherche DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

10. Personnel : = Réservoir/vecteur potentiel d’agents infectieux Bras/mains/poumons = sources de contact et/ou contamination • LIMITATION DES ACCES • RESPECT DES BPL • VETEMENTS PROTECTEURS • • Blouses • • Gants en cas de contact direct avec des toxines, • du sang,des matières infectieuses ou des animaux infectés • •  Chaussures de travail •  Masques • risque infectieux DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

11.  Prévoir un endroit pour suspendre les vêtements protecteurs  Prévoir un espace près de la sortie pour un panier à linge (vêtements de laboratoire à stériliser avant blanchissage avec détergents/désinfectants) OU vêtements à usage unique : coût vs infection  Installations pour le lavage des mains dans l’animalerie (actionnée/pied ou genou ou commandes automatiques) DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

12. Aliments : • Contrôle systématique des fabrications mais risque de contamination lors du stockage • Stockage dans des locaux aérés et frais • Locaux protégés contre les insectes / rongeurs • Durée de stockage limitée • Matériels d’expérimentation • contrôlé et stérilisé si possible • Matériels biologiques •  contrôlé si possible au plan infectieux avant introduction dans l’animalerie (intérêt des MAP test) DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

13. Air/Ventilation Aérosols : particules internes (solide/liquide) ou viables (virus/bactéries/spores) Origine : mécanique ou humaine (+++) = Facteurs de dissémination des substances dangereuses = Danger potentiel pour le personnel et l’environnement (105 à 107 particules > 0,5 µm/mn émises lors de la parole et de la desquamation cutanée) Les locaux d'hébergement doivent disposer d'un système de ventilation approprié aux exigences des espèces hébergées (niveau de confinement)  fourniture d’un air pur  odeurs, gaz toxiques, poussière et agents d'infection  élimination de la chaleur et de l'humidité excessives tout en évitant les courants d'air nocifs = renouvellement: 8 à 20 volumes/heure selon la densité d'animaux hébergés DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

14. Taille des Aérosols DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

15. Temps de chute en air calme des particules sphériques de densité 1 DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

16. Effluents : respects de l’environnement = maintien des barrières de confinement biologique dans tous les systèmes d’évacuation et d’élimination Les producteurs de déchets sont tenus de s’assurer que toutes les étapes du transport et de l’élimination des déchets s’effectuent en toute sécurité et en conformité avec la loi.  Sans risque de prolifération de la vermine  Sans diffusion des odeurs  Sans dissémination des agents infectieux  Sans contamination de l’environnement  Par une sortie exclusivement réservée DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

17. • Déchets non contaminés :  ordures ménagères  stockés dans un local fermé et élimination • Déchets biomédicaux solides(cadavres d’animaux, produits biologiques….)  stocker dans un congélateur puis éliminésdans des fûts hermétiques stockés dans un local fermé ELIMINATION/INCINERATION PAR DES SOCIETES SPECIALISEES • Déchets biologiques et chimiques liquides  éliminés dans des bonbonnes hermétiques stockées dans un local fermé NEUTRALISATION / TRAITEMENT PAR DES ENTREPRISES SPECIALISES DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

18. 2. ENTRETIEN DES INSTALLATIONS BIONETTOYAGE DETERSION + DESINFECTION «procédés destinés à réduire momentanément la biocontamination d’une surface» = propreté physique ET microbiologique Le + souvent : 0 germes pathogènes  destruction des possibilités de développement Agents pathogènes = bactéries, virus, spores de moisissures… = 0 destruction si protégés par des particules organiques !!!Des mesures sanitaires adéquates ne compenseront pas le transfert d’infection par le personnel !!! DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

19. DETERSION/NETTOYAGE : étapepréalable indispensable à la désinfection But : Éliminer d’une surface ou d’un objet tous déchets, souillures, fibres, particules… par TOUS les moyens nécessaires sans détériorer le matériau Efficacité = respect des 4 éléments du cercle de Sinner Action physico-chimique entre le produit et la salissure La température Action mécanique par brossages et frottements afin de décoller la salissure Le temps d’action du produit nécessaire pour que le produit soit efficace DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

20. 1. Les locaux :entretien facilité par l’existence de revêtements adaptés Corridors et aires de services et pièces d’hébergement des animaux = balayage + lavage avec utilisation de solutions détergentes adaptées  Régulier (> 1/semaine)  après les changements de litière  Après les manipulations importantes Eviter le lavage à grande eau qui perturbe les animaux et dérègle les systèmes de climatisation Eviter l’utilisation d’aspirateur = aérosols DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

21. 2. Le matériel : portoirs, cages, biberons… Lors du changement de litière Réalisé aussi souvent que nécessaire pour que les animaux propres et secs et avec un taux acceptable d’ammoniaque dans les cages Fréquence à définir en fonction : - de l’espèce, de la taille des animaux - de la densité de la population - du type de cage - de la présence de portées - de l’action des substances en essai sur les fonctions digestives et urinaires… Lavage du matériel dans un local séparé : = pré-rinçage à l’eau chaude  détergeant acide (dépôts calcaires) + rinçage + solution détergente (souvent alcaline) + rinçage DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

22. Produits utilisés : détergents à haut pouvoir dégraissant (personnel protégé : blouses, gants,  lunettes…) • Savon ordinaire : • = Emploi peu commode et incompatibilité avec les NH4 IV • Substances tensio-actives (détergents anioniques, cationiques ou amphotères) !!! Contaminations rétrogrades !!!  Ouverture de portes (changement de circulation d’air) Pièces d’équipement mobiles… DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

23. DESINFECTION : Définition AFNOR: Opération au résultat momentané permettant d’éliminer ou de tuer les micro-organismes et/ou d’inactiver les virus indésirables portés par des milieux inertes.  Le résultat de cette opération est limité aux micro-organismes présents au moment de l’opération. • Tous les désinfectants : • ont besoin de TEMPS pour être efficaces • sont actifs sur des surfaces PROPRES • sont d’autant + efficaces que les LOCAUX sont ADAPTES DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

24. Qualités à exiger pour un désinfectant : • Efficacité (spectre d’action adapté aux contaminants potentiels : bactéries pathogènes, bactéries saprophytes indésirables, bactéries sporulés, parasites, virus, champignons) et constance de l’action même en présence de substances interférentes • Innocuitépour lesobjets soumis à désinfection et pour le manipulateur, Stabilité du produit d’origine et du produit dilué connues • Rapidité d’action et rémanence • Simplicité(Souplesse du mode d’application avec propriétés mouillantes :détergents désinfectants) • Bas prix de revient DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

25. Sélection du produit selon l’utilisation : • Désinfection des surfaces : sols, murs, plafonds • Désinfection matériel : cages, petit matériel • Antisepsie du personnel : lavage des mains, douche DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

26. Les désinfectants chimiques 1. Dérivés halogénés(hypochlorite de soude…) Efficacité +++ sur la plupart des micro-organismes Eau de javel : titre minimum = 3,8% = 12° chlorométrique Désinfection de surfaces propres : dilution au 1/10, 10mn Désinfection de surfaces au laboratoire : dilution au 1/8, 10mn 2.Aldehydes(souvent associés aux NHIV) : action lente Formol : bactéricide à forte concentration (G-) sporicide si action prolongée fongicide virucide si action prolongée (action + lente sur virus nus) DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

27. 3. Ammonium IV Pouvoir détergent :nombreux détergents-désinfectants bactériostatiques sur G- et bactéricide sur G+ Activité variable sur virus enveloppés, 0 sur virus nus Non sporicide Fongistatiques !!! Incompatibilité avec les dérivés halogénés, anioniques et phénoliques !!!  activité par matières organiques et eau dure  activité par la chauffage et un pH 7 4. Dérivés alcooliques bactéricides virucides variables non sporicides DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

28. 5. Agents oxydants (acide péracétique, peroxide d’H2) bactéricides virucides fongicides  Activité par matières organiques  Activité à pH acide 6. Biguanides type chlorhexidine : bactéricides non virucides non sporicides fongicides sur C. albicans !!! Incompatibilité avec les dérivés anioniques !!!  activité par matières organiques et eau dure Ne pas mélanger 2 produits mais alternance possible ET CONSEILLEE DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

29. DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

30.  concentration en principe actif •  concentration = risque de sélection d'1 souche pathogène • Ex : Cétrimide (Cetavlon®) présent dans le milieu sélectif du Pseudomonas  temps de contact température pH • dérivés chlorés plus actifs en milieu acide • ammonium IV plus actifs en milieu alcalin  présence d’inhibiteurs • détergents anioniques • = inhibiteurs des ammoniums IV • matières organiques, • eau dure DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

31. Les désinfectants physiques 1. Chaleur humide (= autoclave) Recommandée pour les objets inertes Stérilisation par contact objet/vapeur  objet enfermé dans un récipient étanche = non stérile  en cas de flacon contenant un liquide, le temps de stérilisation est compté à partir du moment où le liquide atteint la T° de stérilisation DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

32. 2. Chaleur sèche : • utilisée pour les objets inertes ne supportant pas l’autoclave • Température et temps minimum à respecter : • 180°, pendant 30 min • 170° pendant 1h00 • 160° pendant 2h00 • 140° pendant 4h00 • 3. Rayon gamma: haut pouvoir de pénétration • = émission à partir du 60Cobalt • Utilisé pour les produits ne pouvant pas être chauffés • (stérilisation des aliments) la nature du matériel à stériliser selon : le volume du matériel le conditionnement DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

33. 4. UV : radiations 2500-2600Å • =action photochimique •  Efficace en surface car faible pouvoir de pénétration • Efficace surmatériaux à bon coef. de réflexion tel l’aluminium poli (0,7-0,8) (acier inoxydable  0,2-0,3) • Efficacité +++ sur unicellulaires • ex: 25µW/mn/cm2 : bactéries • 30 000 µW/mn/cm2 : algues vertes • longévité limitée des lampes UV • (2000-15000h selon nombre d’interruptions remplacement à 3000h) •  efficacité  par la salissure (jusqu’à 80%) • = Utilisation pour les SAS entré/sortie :  30 mn • = la nuit en complément DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

34. Les méthodes de désinfection • Matériel • bain germicide installé derrière la barrière sanitaire pour la stérilisation du matériel destiné à la zone protégée = extérieur des flacons contenant des produits thermosensibles, outils, instruments = Formol, alcools, chlorure de benzalkonium • chaleur humide (autoclave) •  chaleur sèche (four poupinel) DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

35. 2. Locaux • rayonnement UV :l germicide (nettoyage préalable+++) = sas, pièces d’expérimentation….. • pulvérisation germicide : NH4 IV (propriétés mouillantes) = matériel • vapeur de formol :  trioxyméthylène • gaz incolore et irritant, soluble dans l’eau, d  1 • (obturation hermétique du local et arrêt de la ventilation) • désinfectant de surface (0 en profondeur) • pénétration et  pouvoir bactéricide en présence de vapeur d’eau et T° >20°C (opt : 24-30°C) et humidité  80%) • action bactéricide en 20-50 mn (conc : 1g/m3) en absence de particule organique • Aération du local après action (ne pas oublier le circuit de gaines !) • Délai avant ré-intégration : 48h DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

36. 3. CONTRÔLE DE LA DESINFECTION≠ contrôle des produits désinfectants • 0 norme ou méthode standardisée • = mise en œuvre/validation par les utilisateursdes procédures •  surveillance physique : densité en particules • = faible corrélation entre contamination microbienne et particulaire • = faible reproductibilité en zone non contrôlée • surveillance microbiologique AIR/SURFACES Ensemencement de milieux gélosés (passif, impacteur, écouvillon…) = bon reflet de l’aérocontamination à instant « t » • = délai, coût DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

37.  utilisation d’animaux sentinelles = animaux de statut sanitaire définis introduits dans l’animalerie (même souche/origine que les animaux d’expérimentation) Hébergement en cage sans couvercle filtrant évaluation de leur état sanitaire : microbien, virologique... après une période de 15 à 30 j N’empêche pas le contrôle sanitaire à partir d’échantillons biologiques et des data cliniques DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

38. CONTRÔLE SANITAIRE DES ANIMAUX • OBJECTIF : Validation de l’état E (I)OPS/SPF • = s’assurer de l’absence d’organisme pathogène pouvant : •  provoquer une maladie chez l’animal • (animal stressé = plus réceptif à l’expérimentation) • modifier les résultats expérimentaux : résultats biologiques, développement de tumeurs, réponses immunitaires, cellulaires... • représenter un risque de zoonose = maintien de l’état sanitaire validé par l’éleveur ! DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

39. Différentes catégories d’agents infectieux : • agents infectieux principaux : • pathologies modifiants les processus métaboliques • processus diagnostics +++ • élimination par production sous barrière • Ex : virus Sendai, virus de l’hépatite de la Souris, Salmonelles • agents infectieux opportunistes : • communs dans l’environnement • peu pathogènes (animaux immunodéprimés, délai de latence) • élimination :  contact animal/humain • Ex : Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus • agents infectieux divers : • rôle limité comme pathogène/opportuniste DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

40. Sélection des microorganismes à contrôler (1) • Comparaison : liste optimale/moyen de diagnostic • prévalence des agents • coût • agent pathogène de l’animal avec risque de zoonoses • pouvoir pathogène démontré à l’origine d’épidémies cliniquement/biologiquement évoquées ou agent opportuniste (agents opportunistes = incidence faible mais forte mortalité) • interactions documentées avec les processus métaboliques, physiologiques, immunologiques, tumoral… • agent ubiquitaire dans l’environnement ou associé à la flore normale de l’Homme • validité des méthodes de détection : sensibilité/spécificité = sérologie pour virus (sensible, rapide peu coûteux) = cultures bactériennes et virales (sensibilité ) • possibilité detraitement ou euthanasie des animaux et formolisation de l’unité DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

41. Sélection des microorganismes à contrôler (2) • Situation idéale : définis par les utilisateurs des besoins • statut des animaux • risques d’interactions avec les processus étudiés (métaboliques, physiologiques, immunologiques, tumoral… ) • risque spécifique lié à l’introduction de matériel biologique = intérêt des MAP tests • validité des méthodes de détection : sensibilité/spécificité • traitement possible ou euthanasie des animaux et formolisation de l’unité • coût DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

42. recommandations relatives au contrôle sanitaire dans les unités d’élevage par la FELASA(Fédération des Associations Européennes pour la Science de l’Animal de Laboratoire) concernent: • toutes les espèces: souris, rats, hamsters, cobayes, lapins.. • toutes les souches de l’unité d’élevage • résultat  : 0 microorganisme chez les animaux testés • ( élevage) • résultat  : présence du microorganisme/Ac • résultats ultérieurs : jusqu’à éradication • pas d’obligation de tests ultérieurs si résultat rendu positif • programmes de contrôle de routine avec prélèvements réguliers •  programme de diagnostic rétrospectif DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

43. Fréquence des contrôles • = statut sanitaire de la population à l’instant “t” contrôles =  confiance sanitaire • f(sensibilité des tests) • f(infrastructure, mode d’hébergement) : isolateurs, cages ventilées…. • f(qualité hygiène/désinfection) • f(fréquence d’introduction de nouveaux animaux) • f(introduction d’échantillons biologiques) • f(données biologiques) : Ac DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

44. NORMES FELASA Souris, Rats, Hamsters Lapins Contrôle des animaux au quotidien : appétit, aspect du poil, comportement social DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

45. Echantillonnage : Échantillon = N = % d’animaux sains 0,05 = intervalle de confiance de 95% Conditions : population de taille suffisante (> 100) dispersion aléatoire 0 sex ratio ni autres facteurs de sélection prévalence connue (littérature) DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

46. NORMES FELASA : contrôle sérologique Virus ++++ dans les contaminations ou infections rencontrées chez les animaux de laboratoire en élevage ou en expérimentation résultats douteux ou inattendus  contrôles par une technique  résultat (+) : présence d’Ac chez un ou plusieurs animaux, rendus (+) jusqu’à éradication DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

47. NORMES FELASA : contrôle bactérien et fongique (1) • Connaissances  stable quant à l’existence de «nouveaux pathogènes»: •  moyens connaissance/dépistages = quelques nouvelles espèces • ex : Helicobacter  histologie/culture/sérologie/PCR • Diagnostic actuellement exceptionnel chez les rongeurs élevés sous barrière sauf opportunistes et animaux immunodéprimés • liquides de rinçage du nez ou du nasopharynx, de la trachée, du prépuce/vagin, du caecum, et sérum • culture sur milieux non sélectifs et enrichis • sérologies • anatomie-pathologie DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

48. microorganismes Sour . /Rt Ham . Cob . Lap . + + + + Bordetella bronchiseptica + Citrobacter freundii + Corynabacterium kutscheri + Leptospira + Mycoplasma sp. + + + + Pasteurella sp. + + + Salmonella sp. + + Streptobacillus moniliformis b + + + Stretocoques hémolytiques + + Steptococcus pneumoniae + + + + Maladie de Tysser + + + Dermatophytes + Yersinia pseudotuberculosis NORMES FELASA : contrôle bactérien et fongique (2) Résultats (+) : cf sérologie D’autres microorganismes peuvent être recherchés en fonction : des lésions, des signes cliniques, des modifications de certains paramètres physiologiques ou biologiques et des conditions d’élevage DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

49. NORMES FELASA : contrôle parasitologique • Connaissances stables quant à l’existence de « nouveaux parasites » pathogènes. • Diagnostic exceptionnel chez les animaux élevés sous barrière • examen du pelage • examen à l’état frais du contenu caecal et de la paroi interne de l’iléon • examen parasitologique du contenu fécal • arthropodes • helminthes • Eimeria sp. • Giardia sp. • Spironucleus sp. • autres flagellés • Klossiella sp. • Encephalitozoon cuniculi • Toxoplasma gondii • Trichosomoides crassicauda DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »

50. NORMES FELASA : contrôle anatomopathologique • Prélèvement des organes à l’autopsie de routine • peau • cavité buccale • glandes salivaires (rat) • appareil respiratoire • aorte (Lapin) • coeur • foie • rate • tractus gastro-intestinal • reins • glandes surrénales • tractus uro-génital • ganglions lymphatiques • + tous les animaux suspects ou malades DU « Formation spéciale à l’expérimentation animale »