ASIGNACIÓN DE PROTEÍNAS GRANDES. RMN MULTIDIMENSIONAL HETERONUCLEAR

1. ASIGNACIÓN DE PROTEÍNAS GRANDES. RMN MULTIDIMENSIONAL HETERONUCLEAR A partir de un peso molecular de  15 kDa, la asignación de proteínas mediante RMN homonuclear se hace muy difícil debido al solapamiento y al aumento de la anchura de las señales. Para resolver este problema se hace uso de: -RMN multidimensional (3 ó 4 dimensiones). Ventajas: Se eliminan los solapamientos y las ambigüedades en la asignación de las señales. Problemas: Largos tiempos de adquisición de los espectros. Grandes ficheros de datos. -RMN heteronuclear: Doble resonancia (1H, 15N) o tríple resonancia (1H, 15N, 13C). Ventajas: Gran variedad de experimentos diferentes que facilitan enormemente la asignación. Aumento de sensibilidad Problemas: Necesidad de enriquecimiento isotópico (muy caro). Generalmente ambos métodos van combinados.

2. RMN MULTIDIMENSIONAL HETERONUCLEAR DOBLE RESONANCIA (1H, 15N) Se utiliza cuando se puede producir proteína enriquecida en 15N (generalmente mediante sobreexpresión en E. coli con medios mínimos de cultivo y 15NH4Cl como única fuente de nitrógeno). Esto es relativamente barato. Se basa en los experimentos de correlación heteronuclear en los que se transfiere magnetización entre los 15N de los grupos NHx y los 1H unidos directamente a aquellos, que se encuentran acoplados escalarmente. El experimento bi-dimensional de correlación heteronuclear más importante es el HSQC (Heteronuclear Single-Quantum Correlation). Hay otros experimentos similares, como el HMQC, que dan un resultado similar

3. El experimento 2D-HSQC (1H, 15N) Cada pico de cruce representa un par de núcleos 15N y 1H correspondientes a los grupos amida del esqueleto peptídico o a los grupos de las cadenas laterales de Asn, Gln, His y Trp. -Simple de interpretar. -Bastante sensible (constantes de acoplamiento grandes y detección inversa en 1H). -Ausencia de diagonal. El experimento de HSQC puede combinarse con otros experimentos bidimensionales, como el TOCSY o el NOESY para obtener experimentos tri-dimensionales: 3D-TOCSY-HSQC 3D-NOESY-HSQC 15N-HSQC de un dominio SH3 de 62 restos de aminoácido

4. Experimentos de RMN tridimensional de doble resonancia La anatomía general de un experimento 3D es: En un experimento 3D-NOESY-HSQC, en lugar de comenzar la adquisición después del tiempo de mezcla, se inserta una secuencia HSQC con un tiempo de evolución t2 antes del tiempo de adquisición t3. El espectro resultante tiene 3 dimensiones, una de ellas correspondiente a los 15N. Con ello se consigue expandir las señales del NOESY, a menudo solapadas, en una tercera dimensión. Igual puede hacerse con el 3D-TOCSY-HSQC.

5. Análisis de un experimento tridimensional. Para representar y analizar un espectro 3D se representan determinados planos correspondientes a la frecuencia de resonancia de uno de los núcleos (por ejemplo cada 15N de cada grupo amida) o bien fracciones de planos (tiras o strips) que corresponden a las frecuencias de 2 núcleos (por ejemplo cada 15N y cada 1H de cada grupo amida).

6. Representaciones de tiras o strips. Representación típica de tiras del espectro 15N 3D-NOESY-HSQC de un fragmento de una proteína de un virus. Cada tira corresponde a las frecuencias de resonancia de 1H y 15N de cada grupo amida de cada residuo. Mediante este tipo de representaciones es muy fácil identificar los NOEs intrarresiduo e interresiduo facilitando mucho la asignación secuencial. Es este tipo de método se siguen los mismos criterios que en la asignación mediante 2D-RMN.

7. RMN MULTIDIMENSIONAL HETERONUCLEAR TRIPLE RESONANCIA (1H, 15N, 13C) • Cuando el tamaño de las proteínas es > 150 aminoácidos, se suele necesitar el uso de los experimentos de triple resonancia. • En este tipo de experimentos se transfiere magnetización entre los tres tipos de núcleos 1H, 15N, 13C. • Se necesitan proteínas doblemente enriquecidas en 15N y 13C (expresión en bacterias con medios de cultivo mínimos con 15NH4Cl, 13C-glucosa). • Existe una gran variedad de experimentos de 3D-RMN de triple resonancia, la mayoría con secuencias de pulso muy complejas, pero que producen espectros resultantes muy simplificados y fáciles de interpretar. • Otra ventaja es su elevada sensibilidad, debido a las grandes constantes de acoplamiento entre los núcleos que se correlacionan (la magnetización se transfiere a través de uno, dos o más enlaces). • Nomenclatura: Los espectros se nombran utilizando las abreviaturas de los núcleos entre los que se transfiere la magnetización, por orden de uso, pero encerrando en paréntesis aquéllos que sólo se usan para la transferencia pero cuya frecuencia no se detecta. (p.ej.: HN(CO)CA transfiere magnetización desde el H amida al N amida y de éste, a través del C carbonílico, que no se detecta, al C alfa.

8. ESPECTROS 3D-RMN DE TRIPLE RESONANCIA (1H, 15N, 13C) Algunos de los experimentos más comúnmente utilizados son: La magnetización se transfiere desde el H amida via el N hasta el C carbonílico y vuelve por el mismo camino al H amida que es el que se detecta. La magnetización va desde el H amida hasta cada C carbonílico y de vuelta, pasando por en N amida y el C alfa, éste no se detecta.

9. ESPECTROS 3D-RMN DE TRIPLE RESONANCIA (1H, 15N, 13C)

10. ESTRATEGIAS DE ASIGNACIÓN CON ESPECTROS 3D-RMN DE TRIPLE RESONANCIA (1H, 15N, 13C) • La estrategia general se puede ilustrar utilizando en espectro HNCA como ejemplo: • El 3D-HNCA correlaciona cada HNcon el C del mismo residuo y la mayoría de las veces con en C del residuo anterior. • Una proyección del espectro 3D-HNCA sobre el plano 1H-15N se ve igual que un 2D-HSQC. Cada señal representa un residuo. • A cada par de frecuencias 1H-15N debe haber dos señales correspondientes a los dos C correlacionados: el del mismo residuo y el del residuo anterior. Esto permite establecer una serie de correlaciones a lo largo de toda la cadena de la proteína. • El método se facilita combinando el HNCA con un experimento que permita distinguir las correlaciones HN- C intrarresiduo de las interresiduo. Por ejemplo el HN(CO)CA o el CBCA(CO)NH que sólo correlacionan el HN de cada residuo con el C del residuo anterior.

11. ESTRATEGIA DE ASIGNACIÓN CON HNCA y CBCA(CO)NH Representación en tiras de la superposición del HNCA (azul) con el CBCA(CO)NH. Cada tira corresponde al par de frecuencias 1H-15N del grupo amida de cada residuo. Las rojas indican correlaciones HN- C inter-residuo, mientras que las azules son correlaciones intra- e inter-residuo. La línea verde muestra claramente la secuencia de correlaciones a lo largo de la cadena. El CBCA(CO)NH tiene la ventaja adicional de dar información sobre el tipo de sistema de spin de cada residuo mediante los desplazamientos químicos del C.

12. RESOLVIENDO AMBIGÜEDADES. EL HNCO Y EL HCACO Durante la asignación de la cadena principal por la estrategia anterior pueden aparecer ambigüedades debido a que dos residuos coincidan en las frecuencias 1H y 15N de sus grupos amida. Así, el residuo predecesor de un cierto aminoácido no puede determinarse porque hay más de una posibilidad. Para resolver ambigüedades se utilizan otros experimentos, como el HNCO y el HCACO. Cada uno de ellos da un único pico por aminoácido. La ambigüedad se resuelve a través de la frecuencia del CO del aminoácido predecesor.

13. IDENTIFICACIÓN DE LOS SISTEMAS DE SPIN COMPLETOS Los experimentos 3D anteriores sólo permiten asignar los núcleos de la cadena principal, y a lo sumo los carbonos beta de algunos de los residuos. Para la asignación de las cadenas laterales e identificación de los sistemas de spin se puede usar el 3D-TOCSY-HSQC, anteriormente descrito, bien usando 15N o bien 13C en la tercera dimensión. Una buena alternativa a estos experimentos cuando las proteínas son muy grandes son el 13C-HCCH-TOCSY o el 13C-HCCH-COSY. Su principal ventaja es que la magnetización se transfiere por todas la cadena lateral a través de acoplamientos directos entre 1H-13C o 13C-13C unidos por un solo enlace, con grandes constantes de acoplamiento, lo que aumenta la sensibilidad.

14. EL EXPERIMENTO 13C-HCCH-TOCSY En este ejemplo se muestra una serie de tiras de un experimento 13C-HCCH-TOCSY que permiten identificar el sistema de spin completo de una leucina. Cada tira corresponde a la frecuencia del 1H amida y de uno de los 13C de la cadena lateral. El resultado es muy similar al 13C-TOCSY-HSQC.

15. RESUMEN DE LA ESTRATEGIA DE ASIGNACIÓN POR TRIPLE RESONANCIA • Expresar y purificar la proteína doblemente enriquecida en 13C y 15N • Registrar pares de experimentos de triple resonancia complementarios para asignar la cadena principal: • Por ejemplo HNCA + HN(CO)CA ó HNCA + CBCA(CO)NH. • 2. Resolver ambigüedades en la asignación de la cadena principal mediante HNCO y HCACO. • 3. Asignar las cadenas laterales mediante TOCSY-HSQC ó HCCH-TOCSY.